支气管哮喘患儿外周血中miR-138 表达与Th1/ Th2 平衡的关系

廖全辉 王水蓉 黄 龙 蔡 雪 付天明 李科兴

1.成都市龙泉驿区妇幼保健院儿科，四川成都 610100；2.成都市龙泉驿区妇幼保健院妇产科，四川成都 610100；3.成都市龙泉驿区妇幼保健院新生儿科，四川成都 610100

支气管哮喘（bronchial asthma，BA）是由多种细胞和细胞组分参与，以气道慢性炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病，是儿童期最常见的慢性呼吸系统疾病[1]。当前我国儿童BA 的诊治虽然取得较大进展，但仍有30%的患儿未能及时诊断，超过20%的患儿未达到良好控制，因此，BA 防治等相关领域一直是研究热点[2-3]。研究显示，T 淋巴细胞在BA 气道慢性变态反应性炎症中发挥重要作用，其中辅助性T 细胞（helper T cell，Th）1 和Th2 比例失衡是BA 发生的重要基础[4]。非编码RNA 是一类不编码蛋白质RNA，具有调控免疫稳态、炎症反应等作用，与BA 发生密切相关[5-9]。微小RNA（microRNA，miR）-138 是新近发现的一种miRNA，已有研究证实其参与过敏性哮喘、骨关节炎等慢性炎症性疾病的发生发展[10-11]，但关于其在儿童BA 中的作用尚不明确。本研究分析BA 患儿外周血miR-138 表达与Th1/Th2 平衡的关系，以期为BA 防治提供更多依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取成都市龙泉驿区妇幼保健院（以下简称“我院”）2020 年1 月至2021 年3 月收治的103 例BA 患儿为研究对象，根据临床表现分为急性发作期组（42 例）和临床缓解期组（61 例）。急性发作期组男22 例，女20 例；年龄2～12 岁，平均（7.52±2.54）岁。临床缓解期组男33 例，女28 例；年龄3～13 岁，平均（7.48±2.57）岁。纳入标准：①符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016 年版）》[12]中BA 诊断标准；②年龄＜14 岁；③患儿家属或监护人知情研究并签署同意书。排除标准：①先天气道、肺组织发育异常；②合并支气管扩张、过敏性鼻炎、呼吸衰竭、肺结核、气道内阻塞性疾病；③近2 周内呼吸道感染史；④近4 周内糖皮质激素使用史；⑤血液系统、免疫系统疾病。另选取我院同期82 名体检健康儿童为对照组，其中男44 名，女38 名；年龄1～12 岁，平均（7.50±2.63）岁。三组一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血miR-138 和Th1、Th2 相关转录因子水平测定 采集BA 患儿入院时及对照组体检时外周血6 ml，乙二胺四乙酸抗凝，取3 ml 外周血，Trizol 总RNA 抽提试剂（北京普利莱基因技术有限公司，货号：R1030）提取外周血总RNA，TaKaRa 逆转录试剂盒（北京智杰方远科技有限公司，货号：RR036A）转录合成cDNA，进行qRT-PCR 反应，miR-138 正向引物：5’-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA-3’，反向引物：5’-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTCTG-3’；T-bet 正向引物：5’-TGTGACCCAGAGATTGTCT-3’，反向引物：5’-TGCGTGTTGGAAGCGTTG-3’；GATA结合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）正向引物：5’-CGGCAGGACGAGAAAGAGT-3’，反向引物：5’-TAGGGCGGGTAGGTGGTGA-3’。反应体系（总体积10.0 μl）：5 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，引物各0.3 μl，1.0 μl cDNA，3.4 μl ddH2O；扩增条件：95℃预变性90 s，循环1 次，95℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40 次。以U6 作为内参，正向引物：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，2-ΔΔCt法计算外周血miR-138、T-bet、GATA3 相对表达量。

1.2.2 外周血Th1、Th2 百分比和相关细胞因子测定取外周血1 ml 抗凝，RPMI-1640 培养基等体积稀释外周血100 μl，加入10 μl 刺激剂，5%CO2培养箱37℃孵育4 h，加入CD3-PC5 抗体、CD8-PC7 抗体，避光孵育15 min，裂解，破膜，加入白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）-PE 抗体、γ 干扰素（interferon-γ，INF-γ）-FITC抗体，避光孵育20 min，洗涤后赛默飞Attune NxT流式细胞仪检测外周血Th1、Th2 百分比，并计算Th1/Th2。取2 ml 外周血，3000 r/min 离心10 min（离心半径为8 cm），取上清，酶联免疫吸附试验法测定IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ。IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、T-bet 试剂盒购于上海富雨生物科技有限公司（货号：FY-03183H2、FY-03181H2、FY-03188H2、FY-04313H1、FY-04432H2）；GATA3 试剂盒购于上海信帆生物科技有限公司（货号：XFH10177）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间采用单因素方差分析，组间两两比较SNK-q 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关性采用Pearson相关性分析。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组外周血miR-138 表达、Th1 百分比、Th2 百分比、Th1/Th2 比较

急性发作期组外周血miR-138 表达、Th2 百分比高于临床缓解期组、对照组，Th1 百分比、Th1/Th2 低于临床缓解期组、对照组（P ＜0.05）；临床缓解期组外周血miR-138 表达、Th2 百分比高于对照组，Th1百分比、Th1/Th2 低于对照组（P ＜0.05）。见表1。

表1 三组外周血miR-138 表达、Th1 百分比、Th2 百分比、Th1/Th2 比较（）

表1 三组外周血miR-138 表达、Th1 百分比、Th2 百分比、Th1/Th2 比较（）

注 与对照组比较，aP ＜0.05；与临床缓解期组比较，bP ＜0.05。Th：辅助性T 细胞

2.2 三组外周血Th1、Th2 相关转录因子水平比较

急性发作期组外周血T-bet 水平低于临床缓解期组、对照组，GATA3 水平高于临床缓解期组、对照组（P ＜0.05）；临床缓解期组外周血T-bet 水平低于对照组，GATA3 水平高于对照组（P ＜0.05）。见表2。

表2 三组外周血Th1、Th2 相关转录因子水平比较（）

表2 三组外周血Th1、Th2 相关转录因子水平比较（）

注 与对照组比较，aP ＜0.05；与临床缓解期组比较，bP ＜0.05。Th：辅助性T 细胞

2.3 三组外周血Th1、Th2 相关细胞因子水平比较

急性发作期组外周血IL-2、IFN-γ 水平低于临床缓解期组、对照组，IL-4、IL-10 水平高于临床缓解期组、对照组（P ＜0.05）；临床缓解期组外周血IL-2、IFN-γ水平低于对照组，IL-4、IL-10 水平高于对照组（P ＜0.05）。见表3。

表3 三组外周血Th1、Th2 相关细胞因子水平比较（ng/ml，）

表3 三组外周血Th1、Th2 相关细胞因子水平比较（ng/ml，）

注 与对照组比较，aP ＜0.05；与临床缓解期组比较，bP ＜0.05。Th：辅助性T 细胞；IL：白细胞介素；IFN-γ：γ 干扰素

2.4 BA 患儿外周血miR-138 表达与T-bet、GATA3和Th1/Th2 及相关细胞因子的相关性

BA 患儿外周血miR-138 表达与T-bet、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ 呈负相关（r=-0.498、-0.515、-0.464、-0.428，P ＜0.01），与GATA3、IL-4、IL-10 呈正相关（r=0.595、0.518、0.386，P ＜0.01）。

3 讨论

BA 是儿童呼吸内科常见病，随着病情进展可发展为气道重塑，引起气道增厚狭窄，甚至阻塞性通气功能障碍，威胁患儿生命安全，积极探索其发病机制对早期诊断和提升治疗效果意义重大。BA 发病机制可概括为气道炎症-免疫、遗传、神经调节，其中气道炎症-免疫机制是由多种细胞因子、炎症介质、炎症细胞共同参与和相互作用的结果[13]。Th 是调控免疫和炎症的关键细胞，Th1、Th2 均来源于Th 亚群，研究显示，Th1/Th2 失衡在BA 发生发展中扮演重要角色[4]，但关于Th1/Th2 平衡与BA 发病相关靶基因的生物标志物研究较少。

miRNA 是一类长度为20～24 个核苷酸的非编码RNA，具备转录后水平调节基因表达功能，可通过调控免疫和炎症反应，参与BA 的发生发展[14]。miR-138位于人染色体3p21.32，既往研究多报道其在多种实体肿瘤中的作用[15-16]。Wei 等[17]研究显示，miR-138 能结合细胞毒性T 淋巴细胞相关分子4、细胞程序性死亡受体1 的3’-非翻译区参与相关免疫反应过程。Shao 等[18]研究显示，miR-138 能通过调节组蛋白去乙酰化酶激活核因子-κB 信号通路，促进类风湿关节炎的炎症进展。本研究结果显示，BA 患儿外周血miR-138 表达明显高于对照组，提示miR-138 参与BA发生。急性发作期是指BA 突然发生或原有BA 症状加重，本研究结果显示，急性发作期患儿外周血miR-138表达明显高于临床缓解期患儿，提示miR-138 可能参与BA 发生发展。

Th 因具有抑制T 淋巴细胞免疫应答功能，在BA发病机制中处于核心位置[4]。前体Th0 细胞可分化为Th1 与Th2，其中Th1 能分泌IL-2、IL-12、IFN-γ、肿瘤坏死因子-β 等细胞，参与细胞免疫；Th2 能分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13 等细胞，参与体液免疫[19]。Th1 分泌的IFN-γ 能抑制Th2 功能和分化，Th2 分泌的IL-4 能抑制Th1 功能和分化。因此，生理状态下Th1 和Th2 的功能和细胞数量是稳定的，以确保两者平衡，若Th1/Th2 失衡，则会抑制T 淋巴细胞免疫应答，触发炎症反应[20-22]。本研究结果显示，BA 患儿外周血Th1 百分比、Th1/Th2 明显低于对照组，Th2 百分比明显高于对照组，这种差异在急性发作期患儿和临床缓解期患儿中仍然存在，提示BA 患儿的Th1/Th2 平衡明显失调，向Th2 方向偏移。同时本研究结果显示，急性发作期组外周血Th1 相关抗炎细胞因子（IL-2、IFN-γ）水平明显低于临床缓解期组、对照组，Th2 相关促炎细胞因子（IL-4、IL-10）水平明显高于临床缓解期组、对照组，提示Th1/Th2 失衡可能导致了炎症反应的发生，符合既往研究报道[4]。强直性关节炎患者外周血miR-138 与Th1/Th2 呈负相关[23]。本研究结果显示，BA 患儿外周血miR-138 与Th1/Th2 呈负相关，提示miR-138 可能通过调节Th1/Th2 平衡介导BA 炎症反应进展。BA 患儿外周血miR-138 与IL-2、IFN-γ 呈负相关，与IL-4、IL-10 呈正相关，进一步证实miR-138 通过调节Th1/Th2 平衡介导BA 炎症反应进展。T-bet 与GATA3 是一种转录因子，能选择性表达于Th1 与Th2，决定Th0 的分化方向[24-25]。本研究结果显示，急性发作期组外周血T-bet 水平明显低于临床缓解期组、对照组，GATA3 水平明显高于临床缓解期组、对照组；临床缓解期组外周血T-bet 水平明显低于对照组，GATA3 水平高于对照组。符合本研究中BA 患儿Th1、Th2 变化趋势。本研究结果显示，BA 患儿外周血miR-138 与T-bet 水平呈负相关，与GATA3水平呈正相关，提示miR-138 可能通过调控T-bet、GATA3 影响Th1/Th2 平衡。

综上所述，BA 患儿外周血miR-138 表达显著上调，可能通过调节Th1/Th2 平衡介导炎症反应，参与BA 发生发展。但本研究样本量较少，同时关于miR-138 与Th1/Th2 的具体调控机制还需体外细胞研究验证。