阿里红多糖对大鼠脑缺血灌注损伤的保护及JAK/STAT信号通路的影响

王 明

(南阳市第二人民医院 神经内科监护室，河南 南阳 473000)

脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是指脑组织缺血一定时间后，恢复血液供应，脑功能不仅没有好转反而加重的现象，是临床缺血性脑卒中治疗的常见并发症[1]，也成为影响缺血性脑卒中临床治疗效果和预后的主要因素。CIRI发病机制复杂，临床治疗途径多样，包括抗凝、抗血小板聚集、神经保护、抑制钙超载、抗氧化作用等[2]。近期研究[3]发现炎症反应在CIRI中扮演重要的角色，过度的炎症反应能够加剧脑组织的继发性损伤。Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信号转导和转录激活因子(STAT)通路是介导炎症反应的常见通路，有研究表明该通路与CIRI的病理生理过程密切相关[4]。因此，通过抑制JAK/STAT信号通路来治疗CIRI成为可能。阿里红多糖为阿里红的主要药用成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[5-6]。有研究报道阿里红多糖具有保护中枢神经元，表现出在神经系统疾病治疗中的潜在价值[7]，但其是否在CIRI的治疗中发挥作用，国内外还未见相关报道。因此本实验通过建立大鼠CIRI模型，阿里红多糖干预治疗，从JAK/STAT信号通路探讨其作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量150～250 g，购自于河南省医学实验动物中心，编号：SCXK(豫)2020-0012。分组饲养于南阳医学高等专科学校实验动物中心，室温控制在20～25 ℃，空气湿度控制在50%～55%，饮食与饮水均标准化供给。

1.1.2 实验试剂与药品 阿里红多糖(四川省维克奇生物科技有限公司，wkq-08919)，临用前用生理盐水配成20 mg/mL；白介素-6(IL-6)(批号：20201103-31063A)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(批号：20201103-31076A)与白介素-10(IL-10)(批号：20201103-31093A)试剂盒皆购自南京建成生物制品研究所；抗体、一抗和山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀释，#ab6721)(Abcam公司，美国)；病理切片及染色试剂均由我院病理科提供。

1.1.3 实验仪器 RT-6100酶标仪(美国Rayto公司)；L500低温离心机(中国湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；TS100显微镜(日本nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、给药及建模 60只大鼠随机平均分为3组，分别为假手术组、模型组、阿里红多糖干预组，其中模型组、阿里红多糖干预组参考文献[8]制备CIRI大鼠模型，模型制作成功的标准：捏着尾部将大鼠提起会出现左前肢弯曲内收，活动时出现追尾征；而假手术组除不插线结扎外，其余步骤同模型组。阿里红干预组给予40 mg/(kg·d)阿里红多糖灌胃，而模型组与假手术组分别给予等量生理盐水灌胃，连续灌胃7 d。

1.2.2 神经功能评分 分别于灌胃后1 d、3 d和7 d对各组大鼠进行神经功能评分，具体评分标准参考文献[9]。

1.2.3 ELISA法检测血清炎症因子表达 神经功能评分实验结束后，通过尾静脉采血，以2 000 rpm离心15～20 min后收集上层血清，抗体反应后显色，酶标仪检测450 nm处吸光度，然后根据标准曲线计算IL-6、TNF-α与IL-10含量。

1.2.4 Western blot检测JAK2和STAT3蛋白的表达 断头处死大鼠，冰面上分离脑组织，匀浆，4 ℃、12 000 rpm离心10 min后收集总蛋白。通过8%的SDS-PAGE分离每个样品中等量(50 μg)的蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜上。室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h。随后，将膜与JAK2和STAT3一抗在4 ℃下孵育过夜，然后将膜与二抗在室温下孵育1 h。使用化学发光试剂显示，使用软件分析灰度计算JAK2和STAT3蛋白相对于GAPDH的表达量。

1.2.5 脑组织病理学切片观察 断头处死大鼠，分离脑组织，去掉小脑，甲醛固定，置于4 ℃冰箱内保存7 d，然后经过不同浓度乙醇脱水、渗透、石蜡包埋。通过切片机将包埋的石蜡组织切片，厚度5 μm，经过HE染色，光学显微镜下观察各组大鼠脑组织神经元形态结构。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分明显升高(P<0.05)；与模型组比较，阿里红多糖干预组大鼠在灌胃3 d、7 d后神经功能评分明显降低(P<0.05)，但在灌胃1 d后神经功能评分没有明显差异(P>0.05)。具体结果见表1。

表1 阿里红多糖对各组大鼠神经功能评分的影响 分)

2.2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α与IL-10含量比较

与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6含量明显升高，IL-10含量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，阿里红多糖干预组大鼠血清TNF-α、IL-6含量明显降低，IL-10含量明显升高(P<0.05)。具体结果见表2。

表2 阿里红多糖对各组大鼠血清炎性因子的影响

2.3 各组大鼠脑组织JAK2和STAT3蛋白的表达

与假手术组比较，模型组大鼠JAK2和STAT3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，阿里红多糖干预组大鼠JAK2和STAT3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。具体结果见图1、表3。

图1 各组大鼠脑组织JAK2和STAT3蛋白表达电泳图

表3 阿里红多糖对各组大鼠脑组织JAK2和STAT3蛋白表达的影响

2.4 各组大鼠脑神经元形态的特点

光学显微镜下观察发现，假手术组大鼠神经元形态结构完整，无异常改变；模型组大鼠神经元肿胀变形，排列紊乱，细胞核变浅或消失，呈现明显的病理变化；阿里红多糖干预组大鼠神经元病变程度得到明显改善。具体结果见图2。

图2 各组大鼠脑组织形态(HE染色，×100)

3 讨论

缺血性脑卒中也称为脑梗死，在中医学中俗称“中风”，是目前导致我国成人残疾、死亡的首要病因[10]。溶栓治疗通过实现血流再通，是临床缺血性脑卒中早期治疗的主要方法，但由此导致的缺血再灌注损伤严重影响患者的治疗效果和预后。

神经功能评分被认为是评价药物对脑功能作用的重要指标[11]，评分越高说明神经元损伤越重，反之越轻。通过本实验研究发现模型组大鼠神经功能评分明显升高(P<0.05)，说明CIRI模型制备成功；通过阿里红多糖干预3 d和7 d后大鼠神经功能评分明显降低(P<0.05)，提示阿里红多糖对CIRI大鼠具有一定的治疗作用。CIRI发病机制至今不明，近来研究表明炎症反应在CIRI损伤中占有重要地位[12]。在炎症反应中，炎症因子发挥重要的作用，其中IL-6、TNF-α与IL-10是炎症反应中常见的三种炎症因子。IL-6是由小胶质细胞和神经细胞分泌产生的细胞因子，正常或低表达时具有对脑组织保护和修复的作用，高表达时具有加剧神经损伤作用[13]；TNF-α属于全身炎症反应的启动因子，可以促进其他炎症因子的释放，从而放大炎症反应的级联效应[14]；IL-10是由多种免疫细胞分泌产生的抗炎因子，能够抑制IL-6、TNF-α等促炎因子的合成和释放，并且还能抑制多种趋化因子导致的免疫放大反应，抑制炎症反应，减轻组织损伤[15]。通过本实验研究发现模型组大鼠血清TNF-α、IL-6含量明显升高，IL-10含量明显降低(P<0.05)，说明CIRI模型大鼠体内产生严重炎症反应；通过阿里红多糖干预作用后TNF-α、IL-6含量明显降低，IL-10含量明显升高(P<0.05)，说明阿里红多糖明显抑制CIRI模型大鼠体内的炎症反应。JAK/STAT信号通路是与炎症反应密切相关的一条干扰细胞内信号转导的通路[16]，其中JAK2和STAT3广泛存在于中枢神经系统中，与脑缺血后的脑组织损伤密切相关[17]。许多炎症因子都是通过JAK2/STAT3信号通路来诱导神经细胞凋亡，引起脑组织损伤，因此抑制JAK2/STAT3信号通路，能够对脑组织起到保护作用[18]。通过本实验研究发现模型组大鼠JAK2和STAT3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，但通过阿里红多糖干预后大鼠JAK2和STAT3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，说明阿里红多糖是通过JAK2/STAT3信号通路来抑制大鼠体内的炎症反应。

阿里红为主产于我国西部和东北地区，尤其是新疆的多孔菌科药用层孔菌的干燥子实体，阿里红多糖为其主要药用成分之一，具有非常好的抗炎作用。有文献报道其通过抗炎对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[19]，且在神经系统疾病的治疗中表现出潜在价值[7]，因此，有理由相信阿里红多糖在CIRI中具有治疗作用，本实验结果与预测相符。

综上所述，阿里红多糖是通过抑制脑内JAK2/STAT3信号通路来减轻CIRI体内炎症反应，从而避免脑组织神经元损伤。