基于网络药理学的大果木姜子油治疗心力衰竭作用机制研究

陈向云，汤小芳，李 军，黄朝霞，杨桃梅，杨长福，李尧锋*

(1.贵州中医药大学 基础医学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学 中药民族药资源研究院，贵州 贵阳 550025)

心力衰竭(Heart failure，HF)是世界范围内发病率和死亡率较高的主要临床问题，其特征是心室收缩和/或舒张功能受损，其临床症状表现为呼吸困难、乏力、水肿、心悸心慌等，是多种心血管疾病的终末期表现[1]。HF常反复发作，病死率高，治疗难度大。近年来，HF在全球范围内日益普遍，且发病率逐年升高，是人类极为关注的公共卫生问题之一。HF发病机制复杂，神经内分泌系统过度激活、心肌能量供应不足或能量代谢障碍等与之有关[1-2]。

中医药在防治心力衰竭上积累了丰富经验，现代中医家根据HF临床表现将其归属于“喘证”“心悸”“心痹”“胸痹”等范畴，认为心气不足、气滞血瘀是心力衰竭的主要病理基础[3-6]。大果木姜子(CinnamomummigaoH.W.Li)，又称苗药米槁，是贵州苗族民间的常用药材，其性温，味辛，无毒，具有温中散寒、理气止痛、祛湿、行气的功能。大果木姜子及其水蒸汽法蒸馏得到的大果木姜子油收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》[7]。现代药理学研究发现，大果木姜子油可减少心肌耗氧量，增加心肌供氧，抗心律失常，改善急性心肌缺血和心房颤动症状[8-10]。近年来，以大果木姜子油为主要成分开发的新药，如理气活血滴丸、心脑宁胶囊、心胃止痛胶囊，为贵州省民族药重要产品，其在防治心血管疾病领域中的应用尤为突出，大果木姜子油应用前景广阔。因此，深入研究大果木姜子油在心血管疾病防治中的作用机制，将为其推广应用提供有力支撑。网络药理学可系统分析中药疗效成分及作用机制，可为中药防治疾病提供潜在靶点分析[11]，利用该方法可清晰呈现大果木姜子油药效作用机制。因此，本研究首先利用异丙肾上腺素(ISO)诱导复制HF大鼠模型，通过动物药理学实验明确大果木姜子油的疗效；然后利用网络药理学分析和分子对接发现大果木姜子油治疗心力衰竭的有效成分及作用靶点，进一步揭示其作用机制，以期为临床应用和药物开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，体质量180～220 g，购自长沙天勤生物技术有限公司(生产许可证号：SCXK(湘)2014-0010)。大鼠饲养于贵州中医药大学基础医学实验中心动物房(温度20～25 ℃，相对湿度50%～65%，明暗相间各12 h)。

1.1.2 药物 大果木姜子油(由贵州益佰制药股份有限公司提供，批号：180428，按照中国发明专利(专利号：2013105216915)，采用水蒸气蒸馏法获得大果木姜子油，1 mL大果木姜子油含生药材32.2 g)。盐酸异丙基肾上腺素(ISO，美国SIGMA公司，5 g in poly btl，批号：I5627)；马来酸依那普利片(扬子江药业集团江苏制药股份有限公司，规格：10 mg/片，批号：20180111)。

1.1.3 试剂与仪器 大鼠脑钠肽(Brain natriuretic peptide，BNP)ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：EL-R0126c)；苏木素伊红(Hematoxylin-Eosin staining，HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：20180312)。

BL-420S生物机能实验系统和HX-101E动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)；Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(美国Thermo Scientific公司)；EG1150H石蜡包埋机、RM2235病理切片机、HI1210摊片机(德国Leica公司)；BX53正置显微镜(奥林巴斯(中国)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 先将SD大鼠随机分为两组：正常组10只，模型组70只；正常组注射等量的0.9%生理盐水，模型组皮下注射ISO(5 mg/kg，每天1次，连续给药7 d)建立心力衰竭大鼠模型，28 d后，模型组大鼠血清BNP 水平与正常组相比显著升高，说明造模成功[12]。然后将造模成功大鼠分为7组，分别是HF组、Tween-80组、Migao-25组(25 μL/kg)、Migao-50组(50 μL/kg)、Migao-100组(100 μL/kg)、Migao-120组(120 μL/kg)、依那普利组(20 mg/kg)。

1.2.2 给药方法 用5% Tween-80水溶液作为助溶剂，加入大果木姜子油，超声破碎仪处理10 min，配制成分别含2.5、5、10、12 μL/mL的大果木姜子油溶液，存储于4 ℃待用。正常组、HF组大鼠灌胃等容积蒸馏水，Tween-80组大鼠灌胃5% Tween-80的水溶液，各给药组大鼠灌胃相应药物，每天1次，连续给药治疗28 d。

1.2.3 血流动力学监测 称量大鼠体质量，采用25%乌拉坦腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧位固定于手术台上，头颈部自然伸直，消毒备皮后，沿颈正中线切开皮肤，做气管插管，接小动物呼吸机。然后采用钝性分离的方法分离出右侧颈总动脉。静脉留置针预充含肝素的生理盐水(含肝素500 U/mL)，将静脉留置针一端沿大鼠右侧颈总动脉向心方向插管进入左心室，静脉留置针另一端接入压力换能器。待大鼠呼吸正常后，压力换能器与BL-420S生物机能实验系统相连，记录大鼠血流动力学指标：左心室收缩压(LVSP)、左心室终末舒张压(LVEDP)、左心室内压最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。

1.2.4 ELISA法检测血清BNP含量 大鼠颈总动脉取血，血液室温静置15 min后，于4 ℃离心20 min(2 500 r/min)。收集上清，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定大鼠血清BNP水平，严格按照试剂盒说明书步骤操作。

1.2.5 HE染色法观察心肌组织形态学情况 取左心室，固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后流水缓慢冲洗去除留在组织上的固定液，经梯度酒精脱水和二甲苯透明后，将标本进行浸蜡、包埋、切片、贴片、烘片，制成石蜡切片。石蜡切片放入苏木精染色液中20 min，分化液分化5 s，自来水浸泡15 min，置于伊红染色液中2 min，自来水冲洗，然后常规脱水，透明，中性树胶封片后，正置显微镜下观察。

1.2.6 大果木姜子油活性成分及作用靶点收集与筛选 根据赵立春等[13]报道的大果木姜子油鉴定出的化学成分，在中药系统药理学数据库和分析平台(TSMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中查找这些化学成分，按照Lipinski类药五规则[14](MW<500Da，Hacc≤10，Hdon≤5，-230%对这些化学成分进行筛选，获得符合条件的大果木姜子油活性成分，并记录其TCMSP ID。在TCMSP数据库中查找这些活性成分的作用靶点，经Uniprot数据库对这些靶点进行标准化。然后利用Cytoscape 3.7.1软件(https：//cytoscape.org/)绘制大果木姜子油活性成分与作用靶点网络关系图。

1.2.7 大果木姜子油治疗心力衰竭候选靶点筛选 以“Heart failure”为关键词，在比较毒理基因组学数据库(CTD，http：//ctdbase.org/)和Drugbank数据库(https：//go.drugbank.com/)中获取疾病的关键基因或靶标，在CTD数据库中选择标记为M(Marker/Mechanism)或 T (Therapeutic)的基因，这些基因与疾病有明确的关联，为疾病治疗靶标或标志物。将疾病治疗靶点与大果木姜子油活性成分作用靶点进行Venn分析(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，找出共有基因，作为大果木姜子油治疗心力衰竭候选靶点。

1.2.8 分子对接 在TCMSP数据库中下载大果木姜子油活性成分的mol2结构，建立小分子配体结构库。在PDB数据库中下载大果木姜子油治疗心力衰竭候选靶点蛋白的三维结构，保存为pdb格式，作为受体库。采用SYBYL©-X 2.1.1软件(Tripos Inc.，USA)对小分子进行分子力学优化，配体优化过程基于Tripos力场Minimize 程序，加氢，加电荷，参数设置为：优化次数设置为10 000、能量收敛标准设置为 0.005 kcal/mol·A、赋予Gasteiger-Hückel电荷，基于 Powell能量梯度法优化得到最低能量构象，以mol2格式文件保存，作为配体小分子用于对接。通过该软件Surflex-Dock模块进行分子对接研究，以打分函数Total-Score为标准评价中药成分与靶标间相互作用，Total-Score>5表明小分子配体与蛋白有较好的结合活性，Total-Score值越大两者结合活性越强[15]。

1.2.9 蛋白互作分析 为了分析作用靶点之间的关系，将靶点蛋白导入STRING数据库(https：//string-db.org/)中，分析蛋白互作关系，分析结果导出Excel格式，再导入Cytoscape3.7.1软件绘制蛋白互作网络图。

1.2.10 蛋白富集分析 使用在线工具DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)对大果木姜子油治疗心力衰竭候选靶点进行GO分子功能(GO-MF)和KEGG通路富集分析，以P<0.05作为显著分析的临界值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大果木姜子油对HF模型大鼠血流动力学指标的影响

与正常组比较，HF组大鼠LVSP、±dp/dtmax均显著降低，LVEDP显著升高，表明HF组大鼠心肌舒缩功能下降，心衰大鼠模型建立已成功。与HF组大鼠比较，Tween-80组大鼠血流动力学指标无变化；Migao-25组大鼠LVSP、±dp/dtmax升高，LVEDP降低，但差异不显著；Migao-50、Migao-100、Migao-120组和依那普利组大鼠LVSP、±dp/dtmax显著升高，LVEDP显著降低，表明大果木姜子油可明显改善HF模型大鼠血流动力学指标，且呈剂量依赖性。见表1。

表1 各组大鼠血流动力学指标情况

2.2 大果木姜子油对HF模型大鼠血清BNP水平的影响

与正常组比较，HF组大鼠血清BNP水平显著升高。与HF组大鼠比较，Tween-80组大鼠血清BNP水平基本无差异；Migao-25组大鼠血清BNP水平有所降低，但差异不显著；Migao-50、Migao-100、Migao-120组和依那普利组大鼠血清BNP水平显著降低，且呈剂量依赖性。结果见表1。

2.3 大果木姜子油对HF模型大鼠心肌组织形态学变化的影响

由以上结果发现，大果木姜子油100 μL/kg具有较好疗效，将该药物组大鼠与正常组、疾病模型组比较，进行心肌组织形态学观察。HE染色结果如图1所示：正常组大鼠心脏被膜完整，心室肌轮廓清晰，心肌细胞排列整齐，心肌纤维连接紧密，胞核清晰，胞浆染色均匀，未见炎性细胞浸润；HF组和Tween-80组大鼠心肌细胞失去正常结构形态，部分出现不同程度坏死，肌纤维断裂、排列紊乱，部分肌纤维结构疏松且肿大，周围有炎性细胞浸润及成纤维细胞增生。Migao-100组和依那普利组大鼠心脏被膜完整，心室肌轮廓较清晰，心肌纤维排列较整齐，未出现明显坏死现象，炎细胞浸润及成纤维细胞增生明显减轻。

图1 各组大鼠心肌组织形态学观察结果(bar=40 μm)

2.4 大果木姜子油活性成分筛选及作用靶点收集

基于TCMSP数据库查找大果木姜子油的化学成分，同时符合OB>30%和Lipinski类药五规则条件的作为活性成分，得到20个(见表2)。在TCMSP数据库中查找这20个活性成分的作用靶点，获54个作用靶点，构建大果木姜子油活性成分与作用靶点网络互作图，其中共有74个节点，265个边，节点代表活性成分或作用靶点，边代表活性成分与作用靶点的互作关系(见图2)。

表2 大果木姜子油活性成分基本信息

图2 大果木姜子油活性成分与作用靶点网络互作

2.5 大果木姜子油治疗HF作用靶点筛选

在CTD数据库和Drugbank数据库中筛选获得疾病治疗靶点107个。大果木姜子油活性成分的54个作用靶点与这107个疾病关键靶点经Venn分析得到6个共同靶点(见图3)，此共同靶点作为大果木姜子油治疗HF的关键候选作用靶点。靶点具体信息见表3。

图3 大果木姜子油活性成分作用靶点与疾病相关靶点Venn图

表3 大果木姜子油治疗心力衰竭候选作用靶点信息

2.6 大果木姜子油治疗心力衰竭候选作用靶点的分子对接验证

为了更好地阐释和验证大果木姜子油活性成分与关键候选作用靶点之间的结合活性，利用SYBYL-X 2.1.1软件对活性成分和关键靶点进行分子对接分析，发现除ADRA2C外其余候选靶点与活性成分(愈创醇、萜品烯-4-醇、沉香螺旋醇、芳樟醇、石竹烯氧化物、龙脑、桧烯)有较好结合活性，见表4。将有较好结合活性的活性成分和作用靶点构建网络关系图，见图4A。

表4 大果木姜子油活性成分与作用靶点的分子对接分析结果

图4 大果木姜子油活性成分-作用靶点-疾病网络(A)及作用靶点蛋白互作关系(B)

2.7 大果木姜子油治疗心力衰竭作用靶点蛋白互作分析

为了进一步探讨大果木姜子油活性成分治疗作用靶点间的互作关系，将这5个靶点导入STRING数据库进行蛋白互作分析(见图4B)，发现它们之间存在互作关系，其中PTGS2与4个蛋白存在互作关系，PTGS1、NOS2和NOS3各与3个蛋白存在互作关系，GSK3B与1个蛋白存在互作关系，表明大果木姜子油在治疗心力衰竭上作用于一个特定的蛋白互作网络中。

2.8 大果木姜子油治疗心力衰竭作用靶点GO分子功能和KEGG通路分析

使用DAVID在线工具进行GO-MF和KEGG通路富集分析(P<0.05)，GO分子功能条目有血红素结合、前列腺素内过氧化物合酶活性、一氧化氮合酶活性等(见表5)，KEGG通路分析得到这些靶点与精氨酸生物合成、代谢通路、精氨酸和脯氨酸代谢等有关(见表6)。

表5 GO分子功能注释

表6 KEGG通路富集分析

3 讨论

网络药理学整合了计算机科学、分子细胞生物学、蛋白组学及药理学等多个学科成果，从整体观认识药物与机体的作用关系，与中医整体观、辨证论治原则一致，为中医药防治疾病的现代化研究提供了新思路。大果木姜子油在防治心肌缺血和心房颤动方面疗效显著，但对其治疗心力衰竭鲜有报道。本研究首先从动物药理学证实了大果木姜子油对心力衰竭的治疗效果，后利用网络药理学揭示了大果木姜子油治疗心力衰竭的作用机制。

BNP是心脏神经内分泌激素，是评价心室功能障碍的重要标记物，为临床诊断、判断心力衰竭严重程度的敏感指标；血流动力学参数也可反映左心室功能不全情况。本研究通过动物实验研究发现，大果木姜子油(50、100和120 μL/kg)可显著升高ISO致心力衰竭模型大鼠的LVSP和±dp/dtmax、降低LVEDP，改善血流动力学紊乱，并降低模型大鼠血清BNP水平；大果木姜子油治疗模型大鼠的最适给药浓度为100 μL/kg，若按生药材量为3.22 g/kg，为后期研究奠定了基础；大果木姜子油(100 μL/kg)可显著改善模型大鼠心肌组织形态学变化，这些结果表明，大果木姜子油可改善ISO所致心力衰竭大鼠的心脏功能障碍。

网络药理学和分子对接研究发现，大果木姜子油治疗心力衰竭共有7个活性成分，分别是愈创醇、萜品烯-4-醇、沉香螺旋醇、芳樟醇、石竹烯氧化物、龙脑、桧烯。这些大果木姜子油活性成分作用于一个特定的蛋白互作网络，该网络中的靶点蛋白与调节前列腺素和一氧化氮代谢有关，进而也与心力衰竭疾病调控机制有关。PTGS1和PTGS2是两种不同的同工酶，介导花生四烯酸转化为前列腺素(Prostaglandin，PG)，是PG合成的重要一步。PTGS1是组成性表达的，主要参与体内动态平衡；PTGS2是可诱导的，通常产生前列腺素类物质，介导对诸如感染和炎症等生理应激的反应[16-17]。哺乳动物基因Ptgs1、Ptgs2分别编码COX-1(Cyclooxygenase-1)、COX-2(Cyclooxygenase-2)，COX-1和COX-2分别是PTGS1和PTGS2的别称[18]。在剪切应力、血管内皮生长因子和凝血酶的作用下，内皮细胞中COX-1表达增加。COX-1参与血小板中血栓素A2的合成，血栓素A2介导血小板聚集和血管收缩[19]。研究发现，COX-2在心力衰竭患者心肌的纤维瘢痕部位有丰富表达，提示其与心衰过程中炎症反应及瘢痕形成有关[20]。COX-2诱导的前列腺素可抑制心肌损伤，PGI2是心脏缺血预处理后COX-2的主要产物，PGI2对心肌细胞有保护作用[21-23]。药物研究发现，上调COX-2表达，可改善左心功能，减轻心肌纤维化[24]；抑制COX-2可增加有心血管疾病或左心室损伤病史患者的心力衰竭症状发生风险[25-26]。一氧化氮合酶在NO信号中尤为重要，心力衰竭时NO生物利用度降低，这是NOS功能障碍的结果，其后果是收缩功能障碍、肥厚和不利的重构，因此一氧化氮合酶功能的改变是心力衰竭综合征的一个主要因素。NOS的功能障碍存在于心力衰竭等多种心脏疾病中，可导致心肌收缩功能障碍、不良重塑和肥大，在心力衰竭疾病中，已发现NOS2的表达与心肌收缩功能障碍和病理性肥大有关[27-29]。因此，在HF防治中，特异性抑制NOS2是一种值得关注的治疗方法。但在HF中，NOS3的表达水平减少，NOS3活性的降低减少了NO产生，这对衰竭的心脏有着极大危害。研究发现，心肌梗死后，NOS3基因敲除小鼠表现出更严重的心室重构、肥厚和收缩功能障碍[30]；心肌细胞靶向的NOS3表达挽救了压力超负荷后的左室重构[31]。此外，在患有心力衰竭肺动脉高压的患者中发现，NOS3多态性与跨肺压力梯度相关，且可能与平均肺动脉压和舒张期肺动脉压差相关[32]。GSK-3是心肌细胞生长和凋亡调节的重要因子，参与心脏的多个病理过程，它的去调节可导致严重的收缩与舒张功能障碍及进展性心力衰竭[33]。研究发现，心力衰竭期间GSK-3的下调可能是补偿性的，对GSK-3的持续抑制可引起代偿性肥大，抑制细胞凋亡和纤维化，并增加心脏收缩力，且GSK-3抑制的抗凋亡作用是由髓细胞白血病因子1介导的[34]。研究还发现，COX-2可调控GSK-3的磷酸化[35-37]。由以上文献分析发现，这些治疗靶点与前列腺素内过氧化物合酶活性和一氧化氮合酶活性有关，与GO分子功能注释和KEGG通路分析一致。

综上，本课题从动物药理学实验研究发现，大果木姜子油可改善心力衰竭大鼠的血流动力学紊乱、降低BNP水平、改善心肌组织形态学变化；利用网络药理学方法分析了大果木姜子油治疗心力衰竭的作用及机制，发现了大果木姜子油治疗心力衰竭的靶点集中于一个蛋白互作网络中，其与前列腺素内过氧化物合酶活性和一氧化氮合酶活性有关，这些结果为今后深入研究大果木姜子油治疗心力衰竭的作用机制提供了依据。