牦牛乳酪蛋白酶解产物抗氧化活性研究

李佳逸，阳辉蓉，陈炼红

（西南民族大学食品科学与技术学院，四川 成都 610041）

牦牛被誉为“高原之舟”，牦牛乳易被人体消化吸收，营养丰富，具有高蛋白、高乳脂率的特点。牦牛乳中蛋白质含量比荷斯坦牛乳高约2倍，氨基酸含量较普通荷斯坦牛乳高出近15%[1]。目前，国内关于牦牛乳及乳中成分抗氧化性的研究也日渐深入。杨静等[2]研究表明，牦牛乳硬质干酪中的抗氧化因子较荷斯坦牛乳硬质干酪高，使干酪在成熟后期的氧化速率变慢。宋雪梅等[3]研究发现，在不同温度和时间下成熟的牦牛干酪制备的水溶性肽均具有抗氧化、杀菌和降压的作用。

酪蛋白是乳蛋白中的主要蛋白质，约占乳蛋白含量的80%以上，营养价值高，功能性强，其独特的氨基酸序列具有很高的研究价值，因此被广泛应用于食药医疗领域[4]。酪蛋白可以通过不同的酶解产生不同的生物活性肽，如抑菌肽[5]、抗氧化肽[6]、血管紧张素转换酶抑制肽[7]。其中抗氧化肽能够清除体内过多的自由基，抑制脂肪氧合酶活性，分解氧化物，增强人体的抗衰老和抗病能力[8-9]。

为进一步研究牦牛乳酪蛋白酶解液在体内及体外的抗氧化性，根据实验室前期研究的最佳酶解工艺条件，采用复合酶解（中性蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶2）制备牦牛乳酪蛋白酶解液，以1,1-二苯-2-苦肼基自由基（DPPH·）、超氧阴离子自由基（O2·）、羟自由基（·OH）清除率及还原力为体外抗氧化活性测定指标，并设置小鼠试验对酶解液在体内的抗氧化活性进行研究，测定小鼠血液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，旨在为抗氧化功能性产品的研发奠定基础，开发出更天然、更安全的抗氧化产品。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

牦牛乳采自四川省阿坝藏族羌族自治州红原牧区，现场将样品装入灭菌的采样瓶中，置于保温盒内当日带回实验室，于4℃条件下冷藏待用；五周龄SPF级昆明系小鼠：体重（25±2）g，生产许可证号为SZXK（川）2020-030，购于四川达硕公司；试验用鼠普通维持饲料，购于江苏省协同医药生物工程有限责任公司。

中性蛋白酶（最适反应pH为7.0，温度为55℃，蛋白酶活力60 000 U/g）、胰蛋白酶（最适反应pH为8.0，温度为50℃，蛋白酶活力250 U/mg）、水杨酸、无水乙醇、硫酸亚铁、过氧化氢、Tris、冰乙酸等，成都瑞普信生物技术有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH），美国Sigma公司；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测试盒、总超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒，南京建成生物工程研究所。

1.1.2 仪器与设备

HC-2062型高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；PL303型分析天平，梅特勒托利多仪器有限公司；UV-2100型分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；PHS-3C型pH计，上海雷磁仪器厂；DZG-303A型纯水仪，成都唐氏康宁艾柯科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牦牛乳酪蛋白酶解液的制备

参考本实验室马宇骥等[10]的工艺制备牦牛乳酪蛋白酶解液。

取鲜牦牛乳，经离心脱脂后加入一定量的去离子水，配制成蛋白浓度为50 mg/mL的溶液。调节pH至7.5，42.5℃水浴锅中预热10 min，加入3%复合蛋白酶（中性蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶2），酶解150 min，酶解过程中每隔20 min用1 mol/L NaOH调节1次pH值，酶解结束后将pH值调至7.0，并在沸水浴中灭酶10 min，冷却至室温，6 000 r/min离心取上清液，冷冻干燥后置于4℃冰箱中备用。

1.2.2 体外抗氧化活性研究

取牦牛乳酪蛋白酶解液冻干粉，分别用蒸馏水配制浓度为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg/mL的蛋白溶液，测定其DPPH·、O2·、·OH清除率及还原力。

1.2.2.1 DPPH·自由基清除率测定

参照You等[11]的方法测定。配制0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，加入2.5 mL样品和2.0 mL DPPH溶液，充分摇匀，用锡纸包裹避光反应30 min，待反应完毕后10 000 r/min离心15 min，以2.0 mL样品加入2.0 mL无水乙醇为对照组，2.0 mL无水乙醇加入等量DPPH溶液为空白组，在517 nm处测定吸光度。同时以同浓度VC溶液代替样品为阳性对照。

式中：A1为样品组吸光度；A2为对照组吸光度；A3为空白组吸光度。

参照刘静等[12]的方法测定。将邻苯三酚和样液在25℃条件下水浴15 min，依次加入2.8 mL Tris-HCl、0.2 mL邻苯三酚和1 mL样品后迅速混匀，用蒸馏水代替样品溶液为对照组，在325 nm处测定吸光度，反应时间为5 min，每30 s测定1次，反应结束后加入0.1 mL蒸馏水和2.8 mL Tris-HCl缓冲液调零。横坐标设为时间，纵坐标为OD值，斜率即为邻苯三酚自氧化速率。同时以同浓度VC溶液代替样品作为阳性对照。

式中：V1为对照组邻苯三酚自氧化的速率；V2为样品组邻苯三酚氧化的速率。

1.2.2.3 ·OH清除率测定

参照董玉玮等[13]的方法稍作修改。依次加入2 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇、2 mL 9 mmol/L FeSO4、2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液和2 mL样品后充分摇匀，空白组样品取2 mL蒸馏水代替样品溶液，对照组加2 mL蒸馏水代替H2O2，37℃反应60 min，充分反应后于510 nm处测定吸光度。同时以同浓度VC溶液代替样品作为阳性对照。

式中：A1为样品组吸光度值；A2为空白组吸光度值；A3为对照组吸光度值。

1.2.2.4 还原力测定

参照王颖颖等[14]的方法并略作修改。

精确量取2.5 mL样品，加入2.5 mL PBS缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液后迅速混匀，50℃水浴保温30 min。反应结束后迅速冷却至室温，再加入2.5 mL 10%（m/V）三氯乙酸溶液，振荡混匀后以6 000 r/min离心50 min。吸取2.5 mL上清液，加入等量蒸馏水和0.5 mL 0.1%氯化铁，混匀后于25℃水浴保温10 min，在700 nm处测定OD值，以双蒸水为空白样。

1.2.3 体内抗氧化活性研究

1.2.3.1 小鼠分组、饲喂及采样方法

SPF级昆明系小鼠40只，雌雄各半，预试3 d后进入正式期（排除小鼠因为运输造成应激反应影响试验结果），将小鼠随机分成4组，每组10只并进行编号（雌雄各半且分隔饲养），分笼饲养于环境温度22～26℃，相对湿度50%～60%的动物房中，每天光照12 h，自由进食进水，喂养普通维持饲料，每天更换饮水和垫料，分组情况见表1。

表1 小鼠灌胃分组Table 1 Mouse gavage grouping

每日上午9点对对照组和试验组小鼠经口灌胃0.25 mL蒸馏水和不同浓度酶解液[15]，周期30 d，同时每组每日供应等量的颗粒饲料，自由进食进水。试验期间保持实验房温度为（24±2）℃，每日12 h灯光照明。

末次灌胃后禁食24 h，将小鼠称重并用乙醚麻醉后进行心脏采血，将血液置于1 mL EP管中，室温下静置30 min，于4℃下以3 000 r/min离心10 min，取上层血清，置于-80℃待检测。

取小鼠脾脏称重，计算脾脏指数。

脾脏指数=脏器质量（mg）/体重（g）

1.2.3.2 体内抗氧化分析

分别采用SOD、MDA、GSH-Px试剂盒进行检测，并按各说明书的公式进行计算。

1.2.4 数据处理

所有试验测定3次，结果取平均值，采用SPSS V22.0统计软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 牦牛乳酪蛋白酶解液体外抗氧化活性研究

2.1.1 酶解液对DPPH·清除能力的分析

如图1所示，蛋白浓度在0～30.0 mg/mL时，牦牛乳酪蛋白酶解液的DPPH·清除能力随着蛋白浓度的增加而显著升高，当浓度大于30.0 mg/mL后，DPPH·的清除能力虽仍继续增加，但不再显著提升。样品中的DPPH·清除率达到66.45%±1.59%时的蛋白浓度为50 mg/mL。VC的DPPH·清除率在浓度0～15.0 mg/mL时有显著提升，之后增长缓慢，浓度为50.0 mg/mL时，VC的DPPH·清除率达到89.02%±1.07%。结果表明，牦牛乳酪蛋白酶解液的DPPH·清除率始终低于VC，但仍具有一定强度的抗氧化活性，在蛋白浓度为50.0 mg/mL时，DPPH·的清除率达到同浓度VC的74.45%。

图1 不同浓度酶解液的DPPH·清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates with different concentrations

图2 不同浓度酶解液的O2·清除能力Fig.2 Superoxide radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates with different concentrations

2.1.3 酶解液对·OH清除能力的分析

研究表明，·OH易与氨基酸、蛋白质和核酸等游离基团相结合，从而造成细胞损伤导致机体产生疾病甚至癌症等危害。由图3可以看出，牦牛乳酪蛋白的酶解液·OH清除能力在0～40.0 mg/mL时随着蛋白浓度的提高而显著增强，之后清除率基本保持不变。在蛋白浓度为5.0 mg/mL时，样品对·OH的清除率只有15.36%±0.68%，但当浓度升至50.0 mg/mL时，样品对·OH的清除率达到了60.40%±1.96%，是相同浓度下VC对·OH清除率的61.65%；样品与VC的·OH清除能力在浓度0～10.0 mg/mL时基本相同。但随着浓度的增加，酶解液的·OH清除能力增速低于VC，当浓度升至30.0 mg/mL时，VC对·OH清除率显著高于样品。

图3 不同浓度酶解液的·OH清除能力Fig.3 Hyroxyl radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates with different concentrations

2.1.4 酶解液还原力分析

由图4可知，牦牛乳酪蛋白酶解液还原力整体随着蛋白浓度的增加而增强，但浓度在15.0～20.0 mg/mL时，蛋白浓度对牦牛乳酶解液的还原力影响并不显著。当浓度达到25.0 mg/mL后，继续增加浓度，VC的还原力不再显著增强。样品的还原力在蛋白浓度为50 mg/mL时是相同浓度下VC还原力的63.03%。随着浓度的增加，酶解液与VC的还原能力的差距逐渐缩小，但酶解液的还原力始终小于VC。

图4 不同浓度酶解液的还原力Fig.4 Reducing power of enzymatic hydrolysates with different concentrations

2.2 牦牛乳酪蛋白酶解液体内抗氧化活性研究

2.2.1 牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠体重及免疫功能的影响

由表2可见，饲喂30 d后，试验组小鼠体重均高于对照组。与对照组相比，低剂量组小鼠体重无显著变化，中剂量组和高剂量组的小鼠体重均显著增加（P＜0.05），且高剂量组的体重增加最多。牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠脾脏指数的影响，与对照组相比，低、中和高剂量组均有显著增加（P＜0.05），且中剂量组与高剂量组之间无显著性差异。

表2 牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠体重增重及脾脏指数的影响Table 2 Effect of yak casein hydrolysate on weight gain and spleen index of mice

酪蛋白酶解释放的酪蛋白活性肽可增加小鼠的钙吸收率及储留率。除此之外，酪蛋白水解物还含有小分子肽及各类游离氨基酸，小分子肽对动物的生长有促进作用[16]，但具体成分及机制有待进一步的研究。在之前的研究中，郑华等[17]研究发现：用酪蛋白饲喂小鼠24 d后，小鼠体重显著高于对照组；饲喂36 d后，小鼠体重极显著高于对照组，与本试验结果一致，说明酪蛋白可促进小鼠的生长。

机体的非特异性免疫情况可由脾脏指数体现。有研究指出，免疫与抗氧化存在着相辅相成的关系[17]。在本试验中，脾脏指数与牦牛乳酪蛋白酶解液剂量成正比，表明牦牛乳酪蛋白酶解液可以促进小鼠的非特异性免疫。在陈东平等[18]的研究中发现，用不同分子量的酪蛋白肽饲喂小鼠30 d后，饲喂大于3 ku酪蛋白肽的分组，小鼠脾脏指数显著高于对照组，1～3 ku及小于1 ku的分组，小鼠脾脏指数极显著高于对照组，与本试验的结果基本一致，说明牦牛乳酪蛋白酶解液在30 d时可显著提高小鼠的脾脏指数，表明酶解液对小鼠具有显著抗氧化作用。

2.2.2 牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠血清中SOD活力的影响

如表3所示，饲喂牦牛乳酪蛋白酶解液30 d后，与对照组相比，低剂量组、中剂量组及高剂量组的小鼠血清对SOD活力影响均有显著提高（P＜0.05），低、中、高剂量组的SOD活力分别提高约5.65%、12.34%和16.22%，且各组间差异显著（P＜0.05）。

表3 牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠血清中SOD活力的影响Table 3 Effect of yak casein hydrolysate on SOD activity in serum of mice

研究证明：人体衰老、心脑血管等疾病均与人体内SOD活力的降低有关[19]；同时，生物的致死率上升与机体内的SOD活性下降呈正相关[20-21]。Lee等[22]在研究鸭皮组织时发现，提高SOD活性可抑制抗氧化系统损伤，增强机体的抗氧化能力。在本试验中，用不同剂量的酪蛋白酶解液饲喂小鼠30 d后发现，试验组的小鼠血清中SOD活力明显高于对照组，且低、中、高剂量组的SOD活力呈梯度性变化，说明牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠SOD活力的提高有显著影响，进而提升小鼠的抗氧化能力。

2.2.3 牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠血清中MDA含量的影响

由表4可见，经30 d饲喂牦牛乳蛋白酶解液后，低、中、高剂量组小鼠血清中MDA含量与对照组之间差异显著（P＜0.05），但试验组间差异不显著，低、中、高剂量组的MDA含量相较于对照组分别下降了约17.96%、19.39%和23.67%，呈逐渐下降的趋势。

表4 牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠血清中MDA含量的影响Table 4 Effect of yak casein hydrolysate on MDA content in serum of mice

机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，非酶系统能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，由此引发脂质过氧化作用，最终形成脂质的过氧化物（酮基、羰基、醛基等）。MDA作为其中主要的毒性产物，不仅可导致细胞内环境紊乱，致使细胞凋亡，而且也可改变DNA及RNA序列的转录翻译工作，使细胞环境失衡[23]。因此，MDA含量能间接地反映出细胞氧化损伤的程度，其与机体受损程度呈正相关。

本试验中，小鼠在饲喂酪蛋白酶解液30 d后，血清中的MDA含量明显下降，说明酪蛋白酶解液可有效减少机体内脂质过氧化物，降低细胞的损伤程度，提高机体的抗氧化作用。

2.2.4 牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠血清中GSH-Px活力的影响

由表5可以看出，低、中、高剂量组小鼠血清中GSH-Px活力均显著高于对照组（P＜0.05），但试验组之间差异不显著。低、中、高剂量组的GSH-Px活力较对照组分别升高了约30.89%、37.72%和48.98%，呈逐渐上升的趋势。

表5 牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠血清中GSH-Px活力的影响Table 5 Effect of yak casein hydrolysate on GSH-Px activity in serum of mice

GSH-Px能将还原性谷胱甘肽（Glutathione,GSH）催化为氧化型谷胱甘肽，是测定GSH活性水平的指标之一[24]，其浓度可影响GSH对毒性物质的降解效果以及清除超氧阴离子自由基的效率，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。因此，测定GSH-Px活力可用来作为判别机体抗氧化性能的指标。本试验中可以看出，牦牛乳酪蛋白酶解液可以提高机体GSH-Px活力，从而提高机体的抗氧化能力。

3 结论

体外试验通过在最优酶解条件下制备牦牛乳酪蛋白酶解液，测定其抗氧化活性指标。结果表明：酶解液在蛋白浓度为50 mg/mL时对DPPH·、·OH、O2·均具有一定的清除能力，蛋白浓度在0～30.0 mg/mL时的DPPH·清除率和·OH清除率均随着浓度的增加而显著增强，二者在浓度为50.0 mg/mL时的清除率分别达到66.45%±1.59%和60.40%±1.96%，相当于相同浓度下VC对其清除率的74.45%和61.65%。还原能力除15.0～20.0 mg/mL外，整体均随着蛋白浓度的增加而显著增强，当浓度升至50.0 mg/mL时，还原力达到了1.775±0.004，是相同浓度下VC还原力的63.03%。在蛋白浓度为0～45.0 mg/mL时，牦牛乳酪蛋白酶解液对O2·的清除率随着蛋白浓度的增加而显著增强，浓度升至50.0 mg/mL时，酶解液的清除能力达到了46.02%±2.26%。

体内试验结果表明：经灌胃30 d后，试验组小鼠体重及脾脏指数均高于对照组；试验组小鼠血清中的SOD活力、MDA含量、GSH-Px活力与对照组之间差异均显著（P＜0.05）；试验组组间的SOD活力差异显著（P＜0.05），MDA含量、GSH-Px活力差异不显著。以上数据表明，试验组小鼠较对照组而言，体重及脾脏指数均有增加，说明牦牛乳酪蛋白酶解液对小鼠的生长及非特异性免疫有促进作用；与对照组相比，试验组小鼠血清中SOD活力与GSH-Px活力均有提升，MDA含量有一定程度的下降。

本试验结果表明：牦牛乳酪蛋白酶解产物在体外和体内均表现出较好的抗氧化活性，为牦牛乳抗氧化功能产品的研究提供了理论依据，在天然抗氧化剂应用中具有广阔前景。