圣女果酵素的制备工艺及抗氧化性质研究

韦青海，沈瑞敏，周伟泽，梅道源

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北 武汉 430205）

“酵素”是以果蔬或粮食为原料，或保留或经微生物发酵代谢形成一些活性成分[1]，具有润肠通便、解酒护肝、净化血液、消炎抗菌等功能，在食品、化妆品和农业中有较广泛的应用[2]。近年来，关于酵素的研究也在逐步深入，但大多采用固态发酵生产酵素，生产周期较长。黄海、战伟伟、杨婧娟等人[3-5]分别采用固态发酵研制了不同的复合酵素。梁贵秋等人[6]以桑葚为原料自然发酵，通过错流过滤系统分离出混合菌群，利用混合菌群制备桑葚酵素。杨培青等人[7]对以蓝莓加工过程产生的废弃物-果渣为核心原料，完善优化了发酵工艺。另外，蒋增良、卢梦瑶等人[8-9]也分别对酵素的生物活性进行了研究，以及从酵素中分离鉴定了一株高产醋酸菌。试验以圣女果为原料直接利用活性干酵母和乳酸菌粉分步液态发酵制备圣女果酵素，并研究其抗氧化活性，不仅大大缩短酵素的生产周期，简化生产步骤，而且可以利用圣女果的营养价值制备出具有通便、美白、抗前列腺癌效果的健康食品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

圣女果，产自广西百色；酵素（食品级），世康食品专营店提供；安琪活性干酵母（食品级），安琪酵母提供；酸奶发酵剂（食品级），北京川秀科技有限公司提供；乙二胺四乙酸二钠（AR）、三羟甲基氨基甲烷（AR）、邻苯三酚（AR）、维C（AR），国药集团化学试剂有限公司提供；DPPH（优级纯），福建领江生物科技有限公司提供。

1.2 主要仪器

TS-2102型振荡培养箱，上海天呈实验仪器制造有限公司产品；SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司产品；UV-2000型可见紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；AL104型电子天平，梅勒特-托利多仪器（上海）有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

圣女果→预处理→打浆→杀菌→发酵→检测。

1.3.2 操作要点

（1）圣女果预处理。圣女果去皮、去梗、切碎。

（2）打浆。将称取好的圣女果，加50%纯净水，20%糖混合均匀打浆。

（3）杀菌。将上述圣女果原浆于95℃水浴条件下杀菌30 min。

（4）发酵。将灭菌后的圣女果原浆接种经活化的酵母菌，放置于振荡培养箱中一次发酵后，再接种酸奶发酵剂二次发酵。

（5）检测。对一次发酵液进行SOD酶活力检测，对二次发酵液进行SOD酶活力和总酸检测。

1.3.3 一次发酵条件的优化

取100 g圣女果进行预处理、打浆、灭菌后接种活化后的酵母菌，进行发酵温度（20，24，28，30，34，38，42℃）、接种量（0，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%）、pH值（3.7，3.8，3.9，4.0，4.1）、和发酵时间（8，16，24，32，40 h）的单因素试验，并用四因素三水平L9（34）正交试验优化一次发酵条件。

1.3.4 二次发酵条件优化

在上述1.3.3的最优条件下继续接种酸奶发酵剂，进行发酵温度（33，36，39，42，45℃）、接种量（0，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%）、pH值（5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5）、和发酵时间（8，16，24，32，40，48 h）的单因素试验，并用双指标四因素三水平L9（34）正交试验优化二次发酵条件。

1.3.5 圣女果酵素的性质研究

用上述最优条件制备圣女果酵素，并以维C为对照品对自制圣女果酵素和市售酵素进行抗氧化活性研究。

1.3.6 检测方法

SOD酶活检测方法参考GB/T 5009.171，总酸检测方法参考GB/T 12456，抗氧化活性测定方法参考陈爽等人[10]的研究。

2 结果与分析

2.1 一次发酵单因素试验结果

一次发酵单因素试验结果见图1。

图1 一次发酵单因素试验结果

由图1可知，在一次发酵过程中，温度的增加，中间产物中SOD酶活先增加后减小；酵母菌接种量的增加，SOD酶活先急剧增加后趋于平缓；pH值的增加，SOD酶活基本呈先增后减的趋势；发酵时间的增加，SOD酶活先急剧增加后趋于平缓。考虑成本和效率因素，把一次发酵的温度32℃，活性干酵母接种量0.5%，pH值4.0，发酵时间16 h作为单因素发酵最佳条件，并在此基础上进行正交试验，进一步优化一次发酵条件。

2.2 一次发酵正交试验结果

一次发酵正交试验结果见表1。

表1 一次发酵正交试验结果

由表1可知，在一次发酵的各因素中，发酵温度为主要影响因素，接种量、pH值、发酵时间的影响程度依次递减，此时最优组合为A2B2C3D2，而在9组试验中，最优组合为A2B2C3D1。相同环境下通过验证试验得出A2B2C3D2条件下SOD酶活为593.231 U/mL，A2B2C3D1条件下SOD酶活为560.268 U/mL。故一次发酵最优组合为A2B2C3D2。

2.3 二次发酵单因素试验结果

二次发酵单因素试验结果见图2。

由图2可知，在二次发酵中，发酵温度的增加圣女果酵素中总酸和SOD酶活均呈下降趋势；酸奶发酵剂接种量的增加，圣女果酵素中总酸和SOD酶活均呈先增加后减小的趋势；随着pH值的增加，酵素中总酸的含量逐渐减小，而SOD酶活先增加后减小；随着发酵时间的增加，酵素中总酸和SOD酶活均基本呈先增后减的趋势。综合考虑，酵素中SOD酶活和总酸的含量，分别选择最佳的二次发酵单因素条件为发酵温度33℃，酸奶发酵剂接种量0.2%，pH值5.5，发酵时间40 h，并在此基础上进行正交试验进一步优化二次发酵条件。

图2 二次发酵单因素试验结果

2.4 二次发酵正交试验结果

二次发酵正交试验结果见表2。

由表2可知，影响二次发酵的主次因素依次为发酵温度（A）>发酵时间（D）>接种量（B）>pH值（C），二次发酵最优组合为A1B1C1D2，此时总酸含量为0.219 g/L，SOD酶活为324 U/mL。

表2 二次发酵正交试验结果

2.5 圣女果酵素抗氧化性质研究

圣女果酵素抗氧化性质结果见图3。

由图3可知，对比自制圣女果酵素、市售酵素和维C，对DPPH自由基清除能力大小依次为自制酵素>市售酵素>维C标准品；对羟自由基清除能力大小依次为维C标准品>自制酵素>市售酵素；对超氧阴离子清除能力排序为维C标准品>市售酵素>自制酵素。且从质量分数增长趋势可以看出，该圣女果酵素适宜抗氧化质量分数为2.5%。

图3 圣女果酵素抗氧化性质结果

3 结论

圣女果酵素最优发酵条件为水添加量50%，白砂糖添加量20%，发酵温度32℃，活性干酵母接种量0.5%，pH值4.1，发酵时间16 h进行一次发酵；发酵温度30℃，乳酸菌接种量0.1%，pH值5.0，发酵时间36 h进行二次发酵。此时SOD酶活为324 U/mL，总酸含量为0.219 g/mL。

该圣女果酵素的抗氧化能力较强，其中DPPH自由基的清除能力超过了维C，对羟自由基的清除能力接近维C，但对超氧阴离子的清除能力明显低于维C，适宜抗氧化质量分数为2.5%。