中性粒细胞胞外诱捕网在脓毒症中的作用机制与靶点

王瀚黎，田圆综述 梁群审校

脓毒症(sepsis)是由于严重感染的生理反应失调所引起的危及生命的器官功能障碍[1]。脓毒症未得到及时救治可导致严重脓毒症、休克及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，脓毒症患者的住院时间更长，其住院期间病死率更高[2]。脓毒症的发病率与病死率高，发病机制复杂，是重症医学领域的重点研究对象，对脓毒症的成因、进展及其临床治疗的研究和探讨在不断深入。最新的研究认为，中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)在这一进程中发挥了重要的作用[3]。本文以NETs的研究作为切入点，探讨其在脓毒症病理过程中的角色。

1 NETs的发现与研究现状

1.1 NETs的发现、定义与结构 自2004年，Brinkmann等使用脂多糖(LPS)来诱导家兔外周循环中的中性粒细胞，首次发现了中性粒细胞胞外诱捕网，这是免疫系统中新发现的一种消灭病原体的方式[4-5]。这种新的免疫细胞杀伤病原微生物的机制是由核DNA构成了其结构骨架，在核DNA的骨架上附着有抗菌肽、组蛋白等多种杀菌因子，这些成分在NETs捕获并杀死病原微生物的过程中起到了关键的作用[6]。在电子显微镜中可以看到，核DNA丝的直径为15～17 nm，其上镶嵌的多种球形杀菌因子直径约25 nm，其中有多种组蛋白和中性粒细胞弹性酶(NE)[7]。在中性粒细胞中各类组蛋白约占蛋白总数的70%，其他成分还包含组织蛋白酶G等[8-9]。其他研究表明,NETs中还含有基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、组织因子(TF)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)等成分[9-12]。

1.2 NETs的生成 目前已有3种途径被证明可以诱导NETs生成，并且不同的诱导方式使得NETs的形成方式出现了差异[13]：(1)金黄色葡萄球菌诱导中性粒细胞核膜的破裂，核膜形成的囊泡包裹着DNA转移至细胞膜上，这些囊泡与细胞膜融合并向细胞外释放其中包裹的DNA，便形成了NETs，这一过程需要30～60 min的时间[14]。在这一方式中，中性粒细胞的细胞核和细胞膜并不会遭到完全的破坏，细胞的活性和吞噬功能是被保留下来的，所以也称为活性NETs[15]。(2)在肉豆豆酸酯(PMA)介导下，中性粒细胞核膜发生了降解，其中包裹的染色体去致密化，最终在经过3～4 h后导致整个细胞的裂解；另一些研究则表明这种去致密化的途径受到NE和髓过氧化物酶(MPO)协同的影响[16-17]，而以上这一过程中，被激活的中性粒细胞变为扁平，染色质裂解，进而死亡，所以也被称为自杀性NETs[15]。(3)还有一种由ROS依赖的中性粒细胞释放线粒体DNA的NETs形成机制，该机制未完全阐明，有待进一步研究[18]。

中性粒细胞是人体免疫防御的主阵地，NETs被证明在杀灭病原微生物的过程中作用显著[19]，是免疫系统的重要一环；NETs在脓毒症病理过程中，除了杀灭病原体，对凝血功能、血管内皮也有影响[20-21]。此外，NETs在其他炎性反应、免疫等相关疾病中，也有较为广泛的影响：NETs参与动脉粥样硬化的病理过程[22]；NETs在系统性红斑狼疮、糖尿病、阿尔茨海默病、肿瘤当中都发挥着作用[23-26]。

2 NETs作用途径机制

在脓毒症的病理过程中，对于人体免疫系统具体是如何发挥作用的并没有定论，目前较为公认的观点是Bone提出的：人体促炎反应和抗炎反应之间的失衡在脓毒症病理过程中扮演了重要角色，在二者交替制衡的复杂机制过后，最终导致致命性的免疫抑制；而过往的研究已经证实，NETs在这一过程中发挥了其特有的作用[27]。目前认为其在杀灭病原体的同时也造成了凝血功能障碍并使血管内皮损伤[28-30]。

2.1 NETs杀灭病原微生物 NETs杀灭病原微生物的主要原理是通过其网状结构来捕获和固定病原体，这样就可以阻止病原体在人体内无序的扩散，并使其长时间暴露于局部的高浓度抗菌蛋白中以便各种杀菌成分对病原体进行杀伤。实验证明，NETs可以快速地杀灭病原微生物，其具备迅速地隔离病原微生物表面结合阳离子的能力，可以破坏病原微生物细胞膜的完整性并溶解细胞，可以在几分钟内杀灭病原微生物[26]；在NETs杀伤的过程中，DNA结构完整性非常重要，一旦DNA结构被破坏，脱氧核糖核酸酶(DNase)会导致NETs失去杀菌能力,在体外试验中，向细菌中添加经过稀释的DNA后，通过干预DNase的水平，细菌的生存率会随着DNase水平的降低而降低[31]。在较早的一项临床试验中，也有研究者指出，循环中的游离DNA(cfDNA)水平与多器官功能障碍评分、白细胞计数和MPO水平相关联，但是其具体关系受限于样本量并未得出有效的结论，在该项研究中cfDNA与患者病死率呈正相关[32]。

而作为NETs中重要的杀菌成分——组蛋白[6]，它的抗菌能力是在1942年被首次发现的，组蛋白中有2个H2A-H2B二聚体和1个H3-H4四聚体[33-34]，H2A-H2B的抗体可以拮抗NETs的杀伤作用。H2A以2 mg/L的浓度可以在半小时内杀死金黄色葡萄球菌，其效果甚至优于一些经典抗生素[35-36]。但在组蛋白杀灭病原体的同时，其在血液中的浓度被认为与脓毒症病死率呈正相关，并且纯化的组蛋白可以直接对心、肺等脏器造成损伤，也介导了强烈的炎性级联反应，促进凝血反应，而尚没有特定靶点或者药物可以及时阻断这一系列反应，对脓毒症患者来说，凶险的免疫抑制会不可避免的发生，这是致命的[33-37]。

2.2 NETs与脓毒症凝血功能障碍 脓毒症可诱发全身凝血系统激活，最终导致严重的凝血功能障碍，在脓毒症的初期，炎性因子大量释放进入外周循环促使机体进入一种高凝状态，在这种状态下与凝血相关物质将会被大量消耗，所以在接下来的疾病进程中，患者将处于一种异常的病理性低凝状态，并在下一个阶段出现继发性纤溶亢进[38]。而NETs在这一过程中主要起到促凝作用，它会增加血小板黏附、活化和聚集的程度，促使血小板血栓形成，这一过程本身是一种人体防御机制，它的作用在于可以将病原体隔离在一个相对固定的区域内并进行直接的杀伤，但这一机制同时也可能会导致DIC的发生几率增加[39]。也有研究表明，另一种模式也会增加血栓的生成，以往的实验中，NETs的各个组成成分已经被证明可以激活凝血系统，McDonald等[40]则在小鼠的脓毒症模型中观测到了对于NETs、血小板、凝血酶之间相互作用的一条轴线，血小板血栓的空间位置和NETs空间位置有明显关联性，NETs的增加促进了小鼠血管内凝血的发展。另一项研究中则证实[41]革兰阴性菌释放的脂多糖可以快速的激活血小板，并诱导中性粒细胞迁移到感染部位，并通过与血小板的相互作用形成聚集体。LPS激活中性粒细胞，释放NETs，并在TF的作用下，形成血小板血栓，并破坏血管内皮。

2.3 NETs在脓毒症中造成血管内皮损伤 内皮细胞是血管与组织间的屏障，对感染起到了防御作用，血管内皮通透性升高被认为会加重脓毒症炎性反应与免疫反应。关于NETs是如何调节血管内皮通透性的，目前的研究仍处于早期阶段，仅对其具体的影响和可能的机制进行探讨[42]。研究表明，肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)直接干预NETs的生成，通过这种途径来抑制NETs，可以明显地降低脓毒症小鼠的肺损伤程度和肺血管通透性[43]。有研究证明，NETs的组成成分之一——瓜氨酸化组蛋白3通过破坏细胞间的黏附连接而导致微血管的渗漏，使血管内皮功能出现障碍，并增加了白蛋白渗出[44-45]。在另一些研究中，NETs当中富含的NE和基质金属蛋白酶等也会破坏内皮细胞的连接，会进一步增加其渗漏性[46]。在健康献血者的血液中进行试验，可以观察到随着血管内皮细胞和NETs接触时间的延长，血管内皮细胞的损伤程度明显加重，并且在更早的试验中脓毒症患者血液中也观察到了类似的现象[47-49]。

3 干预NETs来治疗脓毒症

cfDNA被报道可以作为感染性疾病的敏感性临床检测指标[28]。Dawulieti等[50]发现脓毒症的促炎反应是被cfDNA影响的，它可能是通过第三代聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM-G3)来调节的，该项研究中证实，PAMAM-G3在体外和CLP小鼠模型中都可以阻断Toll样受体9(TLR9)活化，这是一种可以清除促炎物质的聚合物，可以显著地降低脓毒症患者肿瘤坏死因子α水平，所以PAMAM-G3可能具有对脓毒症的治疗潜力[51]。

Toll样受体4(TLR4)是脓毒症的经典通路，它存在于血小板中，并可以直接诱导NETs的生成，而通过抑制TLR4的手段进行干预，可以改善脓毒症患者的预后[52]，这可能是治疗脓毒症的潜在靶点。对TLR4的干预可以影响早期脓毒症中的炎性级联反应[53]，但是对其彻底阻断也有可能会导致机体对内毒素的免疫反应完全失灵，所以笔者认为对其在临床中的应用应采取谨慎态度。

PAD4可以影响NETs的形成，敲除PAD4基因的脓毒症小鼠模型抑制了NETs的生成，存活率提高，器官功能障碍程度降低[54-55]。另有研究则证实应用PAD4抑制剂既可以影响小鼠中性粒细胞中的整合素相互作用蛋白-3(kindlin-3)，又可以抑制由NETs引起的免疫血栓形成[56]。因此，PAD4可能是抑制NETs和减少血栓生成的治疗靶点。这也是在脓毒症的治疗过程中比较受到关注的内容。

NLRP3炎性小体(一种检测致病微生物和应激源的复合蛋白)与白介素-1β之间存在交互作用，即NLRP3炎性小体可以激活IL-1β，反之亦然[57]。而白介素-1β是NETs的关键诱导因子，则可以认为干预NLRP3炎性小体也可以干预NETs的水平，进而实现对脓毒症的治疗。格列本脲原本是治疗糖尿病的一种药物，但是在研究中发现其可以阻断NLRP3炎性小体的激活，但在临床研究中发现其抑制NLRP3炎性小体激活所需剂量过高，会造成较为严重的低血糖[58]；但格列本脲的一种中间底物——16673-34-0，既可以阻断NLRP3炎性小体又不会造成低血糖，它可能会成为一种潜在的替代药物[59]。另一种潜在的药物是秋水仙碱，它可以抑制P2X7 ATP受体上的NLRP3炎性小体，并对中性粒细胞的多项功能有调控作用[60]，这也对脓毒症的治疗提供了可能的方向。

而针对前文中提到的组蛋白与NE等成分，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)可以阻断NETs的生成[61]，NE抑制剂则已被证实在脓毒症急性肺损伤和弥漫性血管内溶血方面是非常有潜力的[62]。

4 总结与展望

综上所述，NETs在脓毒症病理过程中起到了重要的作用，其对病原体进行杀伤，且其杀伤病原体的效果可能强于一些典型抗菌类药物。但是也不可以放任NETs无限增长，因为在人体中NETs数量的增加也会显著增加血管中免疫血栓的形成，增加DIC的风险，且会造成血管内皮损伤，这都会升高脓毒症患者病死率。所以对于通过干预NETs的生成和调节其表达来治疗脓毒症的方法应该是谨慎的，但也是非常值得深入探讨的。目前来看，根据对患者指标的衡量来控制NETs的水平可能是较适合的治疗方式，这也意味着对能够敏感体现NETs水平的有特异性且便于测量的生物标志物将会是非常有价值的；而对NETs影响血管内皮功能的研究可能是未来的研究方向。并且在其他领域的研究中发现，除中性粒细胞外，嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞均被观察到可以释放胞外诱捕网，所以认为胞外诱捕网可能是一种免疫相关细胞的特殊机制，但是其具体的功能和可能的干预措施均有待研究。相信通过对NETs研究的深入，并合理干预NETs的水平，可以使患者获得健康。