泛连接蛋白1参与炎症调控和抗炎作用的研究进展*

窦 琴,吴秋妹 综述,羽晓瑜 审校

(同济大学附属上海东方医院，上海 200123)

细胞间信号传导和物质传递是细胞维持正常生物学功能的重要方式，泛连接蛋白1(Pannexin 1，Panx1)大孔通道蛋白家族在该过程中发挥重要作用[1]。Panx1在肝脏、心脏、肺脏、脑部及眼睛、耳蜗、前列腺、甲状腺、垂体、视网膜等各类细胞中广泛表达，在维持人体心血管系统、呼吸系统、消化系统、神经系统、免疫系统正常功能中发挥关键作用。Panx1是细胞膜上连接蛋白，将细胞内腺苷三磷酸(ATP)释放至细胞外，参与细胞内外信息传递[2]，参与调节细胞分化和迁移，促进细胞发育和再生，参与伤口愈合、细胞清除、感染和癌症发生等过程[3-6]。本文将通过阐述Panx1在炎性反应中的调节作用和分子机制的最新研究进展，为抗感染治疗提供新的研究视角。

1 Panx1概述

1.1 Panx1基本结构

Panx1单体为4次跨膜结构，在细胞膜上寡聚化形成Panx1通道蛋白。Ruan通过低温冷冻电镜发现人源野生型Panx1是七聚体的组装模式，中间的主通道可以通过ATP大分子，外侧7个小通道是重要的离子通道[7]。Ruan同时解析了ATP通透性的限制性位点，揭示了细胞外端74位的色氨酸形成一个直径小于10埃的门控环，选择性调控ATP通透性的机制[8]，提示该位点可以成为Panx1特异性调控位点。细胞通过Panx1通道开放将细胞内生成的ATP释放到细胞外，胞外游离的ATP作为一种重要的信号分子，引起免疫细胞迁移聚集并诱导炎性反应及其他生理反应。

1.2 Panx1通道开放/关闭

生理条件下，Panx1主通道内入口被其C末端结构封闭，小的阴离子可通过外侧小通道进行离子交换。这些狭窄小通道与主孔相连，并受N端螺旋结构和第一跨膜螺旋之间的长连接体控制。在细胞凋亡过程中，半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)切割C末端的尾部，使Pannexin1主孔道开放，释放细胞内ATP到细胞外，同时释放促进细胞增殖的信号分子进入细胞间液，促进细胞增殖。

1.2.1Panx1通道开放

目前认为Panx1通道开放存在5个阶段：5%、25%、30%、90%和完全开放[9]。Panx1通道的开放分为受体依赖性和非受体依赖性两种，受体依赖性开放是指一些细胞膜上受体(PRs、肾上腺素能α受体、组胺受体)激活促使Panx1通道开放。非受体依赖性开放是指外界因素如机械应力、缺血、缺氧等直接作用于Panx1通道使其开放。Panx1翻译后修饰也可以调节其通道的开放状态，Panx1肽链的抑制性结构CTT可以被Caspase-3/7剪切，从而使Panx1通道持续开放[8，10]。Panx1在炎症、再生和机械信号传导中的功能，以及与Panx1相关的各种P2受体的激活，均与细胞外ATP和K+水平相关。K+刺激Panx1通道释放ATP并从细胞外吸收阳离子进细胞内。激活的受体可使细胞外Ca2+内流入细胞内，细胞内Ca2+浓度升高，诱导Panx1通道开放，细胞内ATP和K+从细胞内外排到细胞外，促进炎症的发生[11]。细胞外低浓度ATP通过和嘌呤受体结合，也可以反馈激活Panx1[12-14]通道开放，诱导ATP释放。

1.2.2Panx1通道关闭

Panx1通道可以被调控关闭，其抑制因子和细胞外ATP浓度是最主要的调控因素。生胃酮(carbenoxolone，CBX)是当前发现Panx1最强的抑制剂，通过封闭Panx1主通道，抑制 ATP释放功能[8]。其他抑制剂4、4′-二异硫氰基芪-2、2′-二磺酸(DIDS)、 NPPB、IAA-94、氟灭酸抑制作用依次减弱。IVAN等[15]研究发现喹诺酮类抗生素也可以阻断Panx1通道，抑制ATP释放。此外，ATP浓度可以负反馈调节Panx1关闭状态。高ATP浓度(1 000 μmol/L)对Panx1通道有60%抑制作用。细胞外ATP的浓度高于普通浓度的50～100倍时，ATP直接作用于Panx1通道，使该通道失活[16]。同时，高浓度ATP也可以诱导关闭Panx1，从而消除ATP释放的正反馈回路[16-17]。

2 Panx1主要生物学功能

正常生理条件下，Panx1的表达受到严格调控。Panx1表达水平的改变(高表达或低表达)与多种疾病的发生发展密切相关。随着Panx1在炎症治疗、癫痫、肿瘤、移植等领域的研究不断深入，其在发育、血压调节、炎症和细胞死亡中的重要作用也越来越引起重视。Panx1通道将细胞内ATP释放到细胞外，分别调节钾离子外流和钙离子内流，参与免疫调节、血管收缩与舒张、神经递质传递、味觉系统和气道纤毛运动等生理功能。目前炎症和癌症之间的相关性已得到充分验证，靶向Panx1治疗癌症的研究也越来越多，抗炎药物已显示出在黑色素瘤等恶性肿瘤中具有良好的预防作用[18]，Panx1已成为肿瘤、急性炎症损伤、应激损伤等多种疾病的潜在治疗靶点[19-22]。

3 Panx1参与炎症调控的机制

在病原体的感染、应激反应、机体损伤或细胞死亡过程中，Panx1在宿主免疫系统都发挥着重要的免疫防御及保护功能[23]。Panx1通道广泛存在各种细胞膜上，参与炎性反应过程和免疫反应。先天性免疫中Panx1的开放释放ATP,促使免疫细胞迁移。SOSHI等[24]研究发现，阻断Panx1可以抑制中性粒细胞和巨噬细胞的迁移，高表达Panx1也可以增加免疫细胞的迁移。该研究还发现，与对照组相比，Panx1基因敲除小鼠中提取出胸腺细胞无法募集巨噬细胞。

越来越多的证据表明，Panx1通道与炎症小体激活，炎性细胞因子释放和炎性细胞募集关系密切。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1型(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)组成的蛋白复合体，简称NLRP3炎性小体，其中效应蛋白 Caspase-1的激活可以进一步促进细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18的释放[25]。高浓度的细胞外ATP作用于核糖磷酸焦磷酸激酶(PRs)，激活炎性小体，促使Caspase-1催化IL-1β前体成有成熟形式的IL-1β，诱发炎性反应。Panx1与P2X7R相互作用可以在细胞膜上形成一个大的高通透性孔道，激活炎性小体。

Panx1通道在适应性免疫中的作用主要体现在Panx1与T细胞的关系。首先，与Panx1诱导的嘌呤自分泌和旁分泌信号激活参与了T细胞增殖和IL-2 mRNA的转录[26]。此外，T细胞与抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APCs)上都有Panx1通道，它们之间的相互作用可以形成免疫突触，T细胞上的PRs既接受来自APCs上Panx1所释放的ATP,也接受自身Panx1所释放的ATP，促进T细胞的激活和增殖，并且参与了免疫突触的形成，在适应性免疫反应中发挥重要作用。TOBIAS等[27]用高渗盐水刺激人外周血白血病T细胞(Jurkat细胞)，诱导Panx1释放ATP，作用于T细胞表面的P2X、R和P2X,R，激活T细胞，促进T细胞的功能。CHRISTOPHER等[28]发现T细胞高表达Panx1有利于Treg细胞和效应T细胞间通讯，下调效应T细胞活性，抑制气道炎性反应。

4 Panx1在急性炎症性疾病中的炎症调控及抗炎作用

4.1 病原微生物感染

大量研究证实，细菌可以释放大量ATP激活Panx1/P2X。产气荚膜梭菌产生的β-毒素可以和P2X7相互作用激活Panx1开放，Panx1通道开放释放的ATP促进寡聚体形成毒素的分泌，导致细胞死亡[29]。越来越多的研究提示，细菌、真菌刺激下Panx1通路活化和炎症发生存在紧密关系[30]。在急性炎症期间血管内皮细胞Panx1通道开放释放ATP可促进白细胞迁移参与炎性反应[31]。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染中Panx1还参与调控CD4+T激活、HIV相关的神经认知障碍，抑制Panx1可以有效控制HIV感染[32-33]。冠状病毒病 (COVID-19)感染中，SARS-CoV-2刺突蛋白和人类冠状病毒229E (hCoV-229E)或其纯化的 S 蛋白可诱导人肺上皮细胞Panx1通道开放，是导致 SARS-CoV-2引发COVID-19的重要原因之一[34]。

4.2 脓毒症

脓毒症病情凶险，病死率高，全球每天约14 000人死于其并发症，难以控制的全身性炎性反应是早期脓毒症的特征，脓毒症发生与巨噬细胞活化及炎性小体激活有关。最新研究发现，巨噬细胞上的P2X受体在脓毒症中有保护作用，与野生型小鼠相比，P2X受体基因敲除的脓毒症模型小鼠短期生存率明显下降，血浆和腹腔灌洗液中的炎症因子水平升高。YANG等[35]发现，Panx1基因敲除小鼠，血清IL-1β水平明显降低比野生型小鼠更耐受内毒素的二次攻击。通过抑制 Pannexin-1降低 NLRP3 炎性体激活和细胞凋亡可以减轻脓毒症诱导的急性肾损伤和脑损伤[36-37]。

4.3 移植后感染

肝移植的成功开展为许多终末期肝病患者带来了生的希望，移植后感染控制是提高移植成活率的重要因素。研究发现，供体肝脏中Panx1的低表达与人类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染有关。 肝移植Panx1-/-小鼠模型证明Panx1缺乏症增加了MRSA在体内的定植，进一步引起肝脏的炎性损伤坏死。低Panx1致减少肝细胞中ATP的释放，进一步降低了肝细胞ATP的P2X受体P2x2的活化[38]。正常细胞坏死过程中，Panx1可以上调炎症细胞因子(如IL-8)的产生，当Panx1被沉默或抑制可以影响炎症的发生。研究发现，混合激酶样蛋白(MLKL)低聚物会激活Panx1通道，同时伴随磷脂酰丝氨酸的丧失，提示Panx1限制了坏死病程中的促炎细胞因子释放[39]。

5 Panx1在慢性炎症性疾病中的炎症调控及抗炎作用

5.1 血管炎症性疾病

血管内皮细胞在血栓形成、创伤愈合及炎性反应中发挥重要作用。血管内皮受损已被视为休克、感染、心血管疾病、肿瘤等多种疾病发生的病理基础，血管内皮细胞中，Ca2+调节通过Panx1通道对核因子-κB(NF-κB)产生反馈作用，从而促进IL-1β的合成，诱导血管炎性反应[40]。FILIPPD等[41]在Panx1缺陷型小鼠中观察到，淋巴功能受损导致的免疫反应降低，可以抵消动脉粥样硬化形成过程中Panx1缺失在内皮和/或单核细胞中的有害作用，提示Panx1对淋巴功能与脂质代谢和动脉粥样硬化斑块发生互相关联进展中起关键作用。

5.2 阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)

阿尔茨海默病又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病。由病毒感染或衰老引起的神经炎症可能导致IFITM3水平升高，促进γ-分泌酶生成，促进β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)的活性,增加AD的发病风险[42]。神经炎性反应中，Panx1介导的信号参与神经元和神经胶质细胞的炎性反应[43]。邻近的神经胶质细胞中的Panx1被激活后，活化的Panx1通道可以促进Aβ导致的级联反应致突触功能障碍。小鼠实验证明，阻断Panx1 可以有效减轻AD的早期突触可塑性缺陷[44]。Panx1在脑部损伤后炎性反应和随后的组织再生过程中均起重要作用[45]。由于Panx1在多种组织中广泛表达并参与多种信号传导途径，因此，连接蛋白被认为是颅脑或脊髓损伤、缺血性中风治疗的新靶标。

5.2 眼部疾病

ANASTASIA等[46]在水性泪液缺乏性干眼小鼠模型中发现，泪腺Panx1 sdRNAi的治疗可以显著降低TSP1-/-小鼠中IL-1β和NLRP3表达调控，提示靶向Panx1的治疗策略可以抑制炎症和/或炎症的信号通路。由于Panx1抑制剂只是短期阻断和部分抑制Panx1功能，所以在临床治疗上可行性高。Panx1参与视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)损伤和视神经头重塑,青光眼发病中，Panx1抑制剂可以阻断炎症小体和离子化的Ca2+流入，而不会影响整体视网膜功能[47-48]。MOHAMMAD等[49]发现，在低渗应激过程中Panx1介导的ATP释放与TRPV4通道激活有关，参与炎性反应。

6 结语和展望

Panx1通道开放关闭是致“ATP诱导的ATP释放”，可以形成正反馈通路活化，因而严格而准确的调控是Panx1生理功能多样性的生理学基础。由于Panx1生理功能多样，还有很多功能和调控机制尚未阐明，需要进一步大量的实验去验证和完善现有研究结论。

早期阻断Panx1通道可以减弱先天性免疫反应，抑制免疫细胞迁移，降低炎症因子的表达，减少组织损伤。晚期激活Panx1可以增强后天性免疫反应，增强T细胞功能，改善免疫抑制状态。目前，炎症和癌症之间的相关性，抗生素-泛素通道-细胞完整性之间相互联系已得到充分确立，靶向Panx1的炎症和肿瘤治疗正成为新的治疗靶点。因为目前临床上还缺乏特异性的Panx1抑制剂，还需要开发更多的Panx1抑制剂以期干预Panx1活化，调控疾病的发生发展；凋亡中Panx1依赖的代谢物释放在体内调节吞噬细胞基因表达，减轻炎性反应，以及其如何选择性表达相关代谢产物的机制还不清楚，仍需要进一步研究探索。耐药性细菌增加和新抗生素的缺乏是人类健康重大挑战，喹诺酮类抗生素可以阻断Panx1通道，提示抗生素、泛素通道和细胞完整性之间相互联系，重组某些喹诺酮类药物可能有助于开发新的抗菌药物。