拮抗性芽孢杆菌Y1的鉴定及其粗提物抗白色念珠菌特性的研究

乔云龙，曾晓龙，黄益芃，杨成

（皖南医学院，安徽芜湖 241002）

芽孢杆菌（Bacillus sp.），由于能产生多种胞外生物活性物质，在医药、食品、农业及饲料工业领域有着广泛的应用前景[1]，其中的抗菌肽类物质往往又是该类芽孢杆菌产生的一类主要活性物质，它们能够造成细胞膜损伤，导致细胞内容物外泄而具有广谱抗菌、抗病毒、抗原虫和抗肿瘤等活性[2-3]，而且芽孢杆菌在一定条件下产生芽孢，对高温、高压、强酸碱、挤压等不良环境的抵抗力很强，并且具有很强的蛋白酶、淀粉酶等活性，也是开发新型微生态多功能剂的首选菌种，且近年来，不断有新的活性芽孢杆菌菌株及抗菌物质被报道[4-6]，因此，对芽孢杆菌类微生物进行研究，为寻找抗生素的替代物开辟了新途径，同时也能在生物防治、微生态制剂中发挥重要作用。

本研究从药用植物车前草组织筛选出一株对白色念珠菌具有很强抑制活性的芽孢杆菌，拟通过形态学观测、生理生化特征及分子生物学手段分析明确该活性菌株种属分类地位，在此基础上对该菌株胞外抗菌活性物质的抗菌特性进行初步研究，为开发具有抗白色念珠菌活性代谢产物提供一定的资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株

芽孢杆菌Y1，白色念珠菌，皖南医学院微生物学与免疫学实验室提供。

1.1.2 培养基

发酵培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH，121℃，15 min；PDA固体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH，121℃，15 min；营养琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，121℃，15 min。

1.1.3 主要试剂与仪器

HBI芽孢杆菌生化鉴定条，批号20201028，青岛海博生物；甲醇、氯仿、正丁醇、乙醚，分析纯，国药集团。

SHZ-82恒温振荡器；ESCD ClassII Biohazard Safe⁃ty Cabinet生物安全柜；LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌器；BECKMAN COULTER Allegra 64R Centrifuge冷冻离心机；Olympus显微镜；PHS-3C型pH计。

1.2 方法

1.2.1 菌株Y1的鉴定

形态学鉴定：将纯化Y1菌株接种至NA培养基上，并置于37℃恒温箱中培养，观察其菌落特征并染色镜检观察菌体形态学特征。

生理生化特征鉴定：《常见细菌系统鉴定手册》[7]方法进行测定。

分子生物学鉴定：将纯化Y1菌株收集菌体，菌株基因组DNA的提取、扩增以及测序纯化由上海生工生物工程股份有限公司完成。采用通用引物7F、1540R进行PCR扩增测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对分析，采用MEGA 7.0构建系统发育树，确定分类地位。

1.2.2 菌株Y1抗菌活性测试

参考文献[8]，将斜面保存的Y1菌株，无菌条件下直接挑取适量接种至发酵液中，37℃，转速为180 r/min条件下培养45 h，12 000 r/min，离心30 min收集上清液，0.22μm滤膜过滤两次，作为无菌发酵液备用待测。然后将白色念珠菌的菌液用无菌水将浓度调整为1×106CFU/mL，用无菌棉棒直接涂布于PDA平板中，用无菌圆纸片蘸取无菌发酵液，放置培养皿中，以无菌水对照，轻轻移至37℃恒温培养箱培养24 h，观察抑菌圈，并测量抑菌圈直径，重复3次，取平均值作为该样本抑菌结果。

1.2.3 粗提物的制备及其抗菌活性测定

将200 mL上清液经旋转蒸发至膏状，分别用20 mL甲醇、氯仿、正丁醇、乙醚抽提5 h，抽提液经旋转蒸发得抽提物；将抽提物用无菌水配制成100 mg/mL的抽提物溶液，经0.22μm滤膜过滤两次，参照1.2.2操作处理并涂布白色念珠菌液，然后放牛津杯，并让其自然下沉后，吸取100μL抽提物溶液至牛津杯，轻轻移至37℃恒温培养箱培养24 h，观察抑菌圈，并测量抑菌圈直径，重复3次，取平均值作为结果。

1.2.4 培养基筛选

选择LB液体培养基、PDA液体培养基、改良PDA液体培养基、NB液体培养基、沙氏液体培养基，接种45 h后，使用筛选出的最佳有机溶剂，仍按1.2.3方法处理，抽提物溶液浓度为100 mg/mL，实验重复3次，筛选较为理想的培养基。

1.2.5 菌株Y1抗菌粗提物稳定性研究

1.2.5.1 粗提物热稳定性测定

分别于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、121℃条件下处理1.2.4中最佳有机溶剂处理的抽提液30 min，以37℃未处理组为对照，采用牛津杯法测定粗提物热稳定性。

1.2.5.2 粗提物的酸碱稳定性测定

分别用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将粗提物溶液pH值分别调为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，室温处理1 h后，再依次调节为原pH，以原始pH为对照，采用牛津杯法测定粗提物酸碱稳定性。

1.2.5.3 粗提物酶稳定性实验

取粗提物溶液，调节至最适pH值后，使各酶的终浓度控制在1 mg/mL，胃蛋白酶（pH=2.0），酸性蛋白酶（pH=3.0），碱性蛋白酶（pH=10.0），蜗牛酶，37℃水浴1 h，再调整为原始pH值，以相同浓度的未经酶处理的粗提物作对照，每组设3个平行，采用牛津杯法测定粗提物酶稳定性。

1.2.6 最佳培养时间的确定

按上述筛选的培养基进行配制，按1%接种量接种，180 r/min、37℃进行培养，每隔4 h取发酵液30 mL，12 000 r/min，离心30 min收集上清液，旋转蒸干，采用1.2.3中筛选出的最佳有机溶剂2 mL抽提5 h，负压蒸干，将抽提物用无菌水配制成50 mg/mL的抽提物溶液，经0.22μm滤膜过滤两次，进行抗菌活性测定。

2 结果与分析

2.1 菌株Y1的形态学及生理生化特征

接种于NA培养基，菌株Y1菌落如图1A所示，菌落乳白色，近圆形，边缘不规整，表面较为粗糙，有褶皱。革兰氏染色观察如图1B所示，革兰氏染色为紫色，阳性菌，菌体呈杆状，两端比较圆钝，芽孢位于菌体中间，呈无色透明折光小体，被菌体包裹。生理生化特征鉴定结果如表1所示。

图1 菌株Y1菌落及形态特征

表1 菌株Y1的生理生化特征

2.2 菌株Y1 16SrDNA序列分析

通过PCR扩增菌株Y1的16SrDNA序列，片段大小1383bp。利用NCBI数据库进行序列相似性分析，结果发现该菌株Y1与芽孢杆菌属中贝莱斯芽孢杆菌（Bacil⁃lus velezensisHSB1）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliq⁃uefaciensBV2007）、枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilisY17B）等菌株序列相似性均为100%（覆盖率100%）。选取与该种菌株同源性接近的菌株，使用软件Mega7.0构建基于16SrDNA序列的系统发育树（图2），鉴于枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌不能产生卵磷酯酶[9-10]，因此，初步将菌株Y1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。

图2 基于16SrDNA序列构建的菌株Y1发育树

2.3 拮抗性芽孢杆菌Y1抗菌活性的检测

拮抗性芽孢杆菌Y1对白色念珠菌表现的拮抗性结果见图3B所示，菌株Y1发酵液上清液对供试白色念珠菌具有明显的抑制活性，见图3C所示，抑菌圈平均直径达到（20.4±0.5）mm，而无菌水对照组（A）没有出现抑菌圈，表明菌株Y1对供试的白色念珠菌具有明显的抗菌活性，且抗菌成分可能存在发酵液中。

图3 菌株Y1对白色念珠菌拮抗性及抗菌活性

2.4 粗提物的活性测定

根据抗菌活性测试结果可知，抗菌活性可能存在于发酵液中，因此，通过牛津杯法测定不同提取剂（甲醇、氯仿、正丁醇、乙醚）抽提物抗菌活性，其结果如图4所示，甲醇抽提的粗提物活性最高，抑菌直径达（38±0.4）mm，而乙醚则毫无活性，提示该抗菌活性物质的极性较大。

图4 不同有机溶剂抽提物抑菌活性比较

2.5 不同培养基对抗菌物质产量的影响

为了提高菌株Y1抗菌物质产量，在同种发酵条件下，采用常见的5种培养基对菌株Y1进行培养，结果发现，沙氏液体培养基与改良PDA液体培养基可以获得相对较好的抑菌活性，抑菌直径均超过了40 mm，如图5所示，且考虑到改良PDA液体培养基原料易得，成本相对较低，因此，采用改良PDA液体培养基作为进一步实验的发酵培养基，其抑菌效果见图6所示。

图5 不同培养基抗菌活性比较

图6 改良PDA培养基的抗菌活性测试结果

2.6 菌株Y1抗菌粗提物稳定性研究

2.6.1 粗提物热稳定性

由图7可知，粗提物在90℃以下处理30 min后仍然具有较为稳定的抗菌活性，100℃处理后，抑菌活性降低至约83%，121℃高温高压30 min后活性完全丧失，结果表明，粗提物抑菌活性在90℃以下具有很好的热稳定性。

图7 不同温度处理粗提物后的抑菌活性

2.6.2 粗提物酸碱稳定性

由图8可知，粗提物在不同pH处理1 h后，在pH 2.0～8.0具有较稳定抗菌活性和很好的酸碱稳定性，如图8所示，抑菌圈直径与对照组基本相同。与毛馨[11]等人的研究结果相似，当pH=10时，可能恰好是抑菌活性物质最适pH值，抑菌圈最大，达到约（50±0.8）mm，如图8所示，pH>10.0时，粗提物抑菌活性降低。可见，强碱性条件下粗提物活性会受到抑制。

图8 不同p H下粗提物抗菌活性比较

2.6.3 粗提物酶稳定性

由图9可知，粗提物在经过酸性蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和蜗牛酶处理后抗菌活性没有明显减弱，具有较好的稳定性。

图9 粗提物的酶稳定性比较

2.7 培养时间对抗菌活性的影响

抑菌活性随着培养时间变长而迅速增强，在发酵至44 h时抑菌圈直径达到最大（37.1±0.2）mm，随后抑菌活性逐渐减弱，这可能是因为菌体生长速度快，导致营养成分不足，限制了活性代谢物质的产出，结果如图10所示。

图10 培养时间对抗菌活性的影响

3 讨论

贝莱斯芽孢杆菌[12]相比枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和苏芸金芽孢杆菌等，分类地位确定比较晚，是芽孢杆菌属的一个新种。目前，研究者已分离获得多株具有抗菌活性的贝莱斯芽孢杆菌[13-16]。本研究从车前草中分离获得一株对白色念珠菌具有抑制活性的贝莱斯杆菌Y1，经滤纸片法测定该菌株Y1无菌发酵液抑菌圈平均直径为（20.4±0.5）mm。通过发酵上清液抗菌抽提粗体物稳定性及最佳培养时间测试，表明该抗菌成分具有一定的耐热性，90℃处理后抑菌活性开始下降，到121℃丧失活性；当pH>10.0时，粗提物抑菌活性降低；对蛋白水解酶的水解作用稳定性较好，培养到44 h抗菌活性最好，这有利于该菌株进一步大规模的发酵生产，开展活性代谢产物的分离纯化。因此，接下来对其产生的抗真菌物质进行研究，旨在揭示该菌株Y1产生的抗真菌活性成分，为完善贝莱斯芽孢杆菌的拮抗物质研究提供依据。