纳米二氧化钛对圆形盘肠溞的急性毒性研究

孔昊，陈杰，王佳琪，张琦，刘嘉慧，张亮

（南京师范大学泰州学院化学与生物工程学院，江苏泰州 225300）

纳米材料是指通过在纳米尺度内操纵单个分子、原子或分子团，使物质成分重新排列组合后制造出的新型物质材料。其中，纳米二氧化钛是目前国内产量最高、需求量最大、应用最多的纳米材料[1]。纳米二氧化钛应用范围十分广泛，如在日用品、医药用品、生物生长等领域[2]。但同时纳米二氧化钛的广泛应用也导致了其在水环境中大量释放，对环境和公众健康都有潜在的安全隐患[3]。纳米材料在生产和使用过程中可直接或间接通过环境、食物链进入人体，因而我们必须关注其可能存在的安全性问题[4-6]。

ZHU等[7]的研究表明，单独暴露于2 mg/L纳米二氧化钛或2μg/L三丁基锡不会影响鲍鱼（Haliotisrubra）的孵化或畸形率，而联合作用却显著影响鲍鱼的孵化率和变形率，表现出明显的协同效应。ZHENG等[8]的研究表明，纳米二氧化钛对斑马鱼几乎无毒性效应，但能够抑制凯伦藻（Karenia brevis）和骨条藻（Skeletonemacosta⁃tum）的生长。文若曦等[9]的研究表明，100 nm纳米二氧化钛对水藻（Desmodesmussubspicatus）的生长无明显毒性，而25 nm纳米二氧化钛对水藻生长的EC50为44 mg/L。FAN等[10]研究发现，纳米二氧化钛对蓝藻（Cyanobac⁃teria）的叶绿素含量、光合速率、呼吸速率、SOD活性以及超氧阴离子含量均产生一定的影响。

目前，已有的研究多集中于纳米材料对藻类、鱼类、植物等的毒性效应，而关于纳米材料对小型甲壳动物的研究非常少，尤其是纳米二氧化钛对圆形盘肠溞的相关研究未见报道[11-13]。由于圆形盘肠溞对生存水环境质量要求较高，可通过测定其存活率与活跃程度间接反映环境污染物对水环境的污染情况。本研究以圆形盘肠溞为试验对象，研究纳米二氧化钛对其急性毒性和理化性质的影响。旨在为纳米二氧化钛的合理使用及其风险控制提供重要参考和研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料准备

纳米级二氧化钛，分子量79.87，粒径Ф20 nm，Tita⁃nium oxide；圆形盘肠溞，上海沁森生物科技有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 纳米二氧化钛胁迫下对圆形盘肠溞生存的影响

选取大小均匀一致的圆形盘肠溞，试验前24 h换自来水并不再喂食。配制相同体积、不同浓度的二氧化钛溶液后放超声波溶解仪里，使其均匀分布。取18个大小规格一样的玻璃瓶，提前洗净并沥干，每瓶放置20只大小均匀的圆形盘肠溞，分别倒入浓度为0 mg/L（对照组1）、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L的纳米二氧化钛溶液，每种浓度设置3组重复试验，放在恒温培养箱中培养，温度25℃，光照周期24 h。把圆形盘肠溞在瓶中停止运动作为死亡标准，每12 h记录一次圆形盘肠溞的存活数和死亡数。

1.2.2 纳米二氧化钛浓度对圆形盘肠溞理化性质的影响

根据1.2.1确定2 mg/L作为急性毒性的试验浓度，选择运动活跃且大小均匀的圆形盘肠溞，用清水养殖且24 h内不再喂食。用吸管分别吸取50只，加入到浓度为4 mg/L、3 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L和0 mg/L（对照组2）的纳米二氧化钛溶液中，每瓶培养液体积为100 mL，每个浓度设置3组重复。在25℃光照培养箱中培养。在12 h、24 h、48 h测量圆形盘肠溞的相关理化指标。

1.3 测定项目与方法

在培养12 h、24 h、48 h后，取适量圆形盘肠溞，加入磷酸缓冲液碾碎，定容10 mL，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量[14]；分别采用氯化硝基四氮唑蓝光化学还原反应法和愈创木酚法测定超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性[15]。

1.4 数据处理

用Excel 2010对试验数据进行分析处理，采用SPSS19.0进行不同处理间显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 二氧化钛胁迫下对圆形盘肠溞生存的影响

由图1可知，不同浓度纳米二氧化钛溶液对圆形盘肠溞有不同程度的抑制影响。随着纳米二氧化钛浓度的增加，圆形盘肠溞的死亡率呈现升高的趋势。用一元线性回归方程法求得24 h的EC50值为在纳米二氧化钛溶液浓度为2 mg/L时。

图1 24 h时不同浓度二氧化钛对圆形盘肠溞生存特性的影响Fig.1 Effects of different concentrations of titanium dioxide on the survival characteristics of Chydorussphaericus at 24 h

2.2 纳米二氧化钛对圆形盘肠溞SOD活性的影响

由图2可见，不同浓度的纳米二氧化钛处理对SOD活性的影响不同。在12 h、48 h时，随着纳米二氧化钛浓度的升高，SOD活性呈现出下降的趋势；而在24 h时，随着纳米二氧化钛浓度的升高，SOD活性出现“先升后降”的变化，且在1 mg/L时SOD活性达到最高，比0 mg/L的纳米二氧化钛处理提高了133.82%。当纳米二氧化钛浓度大于3 mg/L时，圆形盘肠溞的SOD活性显著下降（与0 mg/L的纳米二氧化钛处理相比）。

图2 纳米TiO2对圆形盘肠溞SOD活性的影响Fig.2 Effect of nano titanium dioxide on SOD activity of Chydorussphaericus

2.3 纳米二氧化钛对圆形盘肠溞POD活性的影响

由图3可见，不同浓度的纳米二氧化钛对圆形盘肠溞POD活性的影响不同。在12 h、48 h时，随着纳米二氧化钛浓度的升高，POD活性呈现出下降的趋势；在24 h时，POD活性随着纳米二氧化钛浓度的升高呈现出“先升后降”的趋势，且在1 mg/L时POD活性达到最高，比0 mg/L的纳米二氧化钛处理提高了23.38%。当纳米二氧化钛浓度大于2 mg/L时，圆形盘肠溞的POD活性显著下降（与0 mg/L的纳米二氧化钛处理相比）。

图3 纳米TiO2对圆形盘肠溞POD活性的影响Fig.3 Effect of nano titanium dioxide on POD activity of Chydorussphaericus

2.4 纳米二氧化钛对圆形盘肠溞MDA含量的影响

由图4可见，不同浓度的纳米二氧化钛对圆形盘肠溞MDA含量的影响不同。随着纳米二氧化钛浓度的升高，在12 h时，圆形盘肠溞的MDA含量随着纳米级二氧化钛浓度的升高呈现“先升后降”的趋势，在2 mg/L时达到最高，比0 mg/L的纳米二氧化钛处理提高了48.71%；在24 h时，圆形盘肠溞的MDA含量随着纳米级二氧化钛浓度的升高呈现出上升的趋势，在4 mg/L时达到最高，比0 mg/L的纳米二氧化钛处理提高了163.15%；在48 h时，圆形盘肠溞的MDA含量在各浓度纳米级二氧化钛条件下无显著差异。

图4 纳米TiO2对圆形盘肠溞MDA含量的影响Fig.4 Effect of nano titanium dioxide on MDA content of Chydorussphaericus

3 讨论

本研究显示，纳米二氧化钛对圆形盘肠溞的急性毒性为2 mg/L（24 h EC50）。前人研究也多证实纳米二氧化钛对藻类生长具有一定的毒性。朱小山等[15]的研究表明，纳米二氧化钛对斜生栅列藻96 h EC50为15.26 mg/L。也有研究表明，纳米二氧化钛对莱茵衣藻和小球藻生长均有抑制作用，但抑制机理不同。纳米二氧化钛对大型溞的急性毒性试验显示48 h EC50为1.26 mg/L，毒性级别为中毒[3]。ZHU等[7]的研究表明，纳米二氧化钛对大型溞有急性和慢性毒性作用，发现48 h时表现出较低的毒性。圆形盘肠溞作为水环境中的微生物，对水生生态系统的平衡和稳定起着非常重要的作用，纳米二氧化钛对其的毒害作用将影响整个水生生态系统平衡。

SOD是需氧生物体内一种含不同金属元素的酶蛋白，是唯一可以消耗超氧化物自由基的酶，是已知酶中催化速率较快的酶之一。POD广泛存在于植物体中，与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。MDA是氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的产物，其产生的量与氧自由基的量及脂质过氧化的程度呈正相关。李艳娟等[24]的研究表明，各浓度纳米二氧化钛处理都能够显著提高杉木幼苗SOD和POD活性，降低MDA的含量。杨涛等[25]的研究表明，纳米铁处理显著提高了贝母叶片POD活性，降低了MDA含量，但对SOD无显著影响。侯东颖等[26]的研究表明，藻细胞的SOD活性随暴露于纳米二氧化钛浓度升高而逐渐降低，且在高浓度（100 mg/L）纳米TiO2作用96 h后，其活性降到最低。

本试验表明，随着纳米二氧化钛浓度的升高，SOD和POD活性都呈现出先升高后下降的趋势，MDA含量呈现出上升趋势。同时，在12 h 2 mg/L的纳米二氧化钛浓度时，圆形盘肠溞SOD活性、POD活性达到最大，同时MDA含量最高。浓度上升到4 mg/L的纳米二氧化钛浓度时，圆形盘肠溞的SOD活性、POD活性和MDA含量呈现些许下降。可能随着纳米二氧化钛浓度的增大，活性氧清除系统功能逐渐降低，活性氧积累越来越多，发生膜质过氧化并发生自由基链式反应。总体来说，低浓度的纳米二氧化钛促使溞体POD和SOD活性升高，以保护溞体免受外来刺激和损伤。然而，纳米二氧化钛浓度过高时，就会超出了溞体清除活性氧游离基的能力，导致SOD和POD活性降低。MDA是生物体内重要的膜脂过氧化指标，浓度越高的纳米二氧化钛对MDA的损伤程度越大。