低GI高虫草素和喷司他丁含量蛹虫草固体发酵条件的优化

胡龙，范秀芝，姚芬，殷朝敏，史德芳，高虹，胡中泽*

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023）（2.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北武汉 430064）（3.国家食用菌加工技术研发分中心，湖北武汉 430064）（4.林下经济湖北省工程研究中心，湖北武汉 430064）

蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北冬虫夏草，含有与冬虫夏草相似的生物活性成分[1-4]，但其子实体的核苷类成分含量与抗氧化活性高于冬虫夏草[5,6]，且冬虫夏草不能合成虫草素和喷司他丁[7]。与冬虫夏草相比，蛹虫草具有明显的价格优势，因此，它是冬虫夏草理想的替代品[8-10]。但蛹虫草子实体栽培周期长，栽培过程需要对温度、光照、湿度等多因素严格控制，生产成本高[11,12]。近年来，有报道指出蛹虫草菌丝体发酵谷物所得到的发酵菌质中也含有虫草多糖、虫草素等，且与子实体中的功效相同[13-15]，因此可考虑用发酵菌质来替代蛹虫草子实体用于产品开发，以缩短生产周期、节约生产成本[12]。

虫草素（cordycepin），化学名为 3′-脱氧腺苷（3'-deoxyadenosine），具有抗肿瘤、增强免疫力、抑菌抗炎、保护肝脏心脏、抗肺纤维化等多种功效[16]，其作为腺苷受体的激活剂，在新冠肺炎防治中起到积极作用[17]。但在使用过程中，纯化后的虫草素在人体内易受腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）的脱氨基作用快速降解，形成无生物活性的3′-脱氧肌苷（3'-deoxyinosine）而失效[18,19]。2017 年，Xia 等[7]发现了虫草素的保护分子-喷司他丁（pentostatin），其分子中的脱氧核苷结构，能与ADA紧密结合并抑制其活性，保护虫草素结构的稳定性，从而有效防止虫草素的降解。

血糖指数（glycemic index，GI）是衡量碳水化合物对血糖反应的一种有效指标[20]。根据GI值的高低，分为高GI（GI＞70）、中GI（55≤GI≤70）和低GI（GI＜55）食品[21]。按照国家标准WS/T 652-2019食物血糖生成指数测定方法的规定[22]，食品的 GI值需要通过测定人体餐后血糖变化量而得，检测过程复杂且费用昂贵，目前我国具备检测能力的机构很少。因此，研究者们大都通过体外消化这一简单有效的方法来测定食品的GI值。为与人体试验测定GI值相区分，研究人员多用预估血糖指数（expected glycemic index，eGI）来表示[23-25]。

前期研究证实了利用蛹虫草对大米发酵，能有效降低大米的eGI值[26]。为进一步降低发酵菌质的eGI值，并提高发酵菌质中虫草素和喷司他丁活性物质的含量，本研究在前期筛选获得蛹虫草菌株基础上以发酵菌质eGI值、虫草素和喷司他丁含量为评价指标，对固体发酵培养基配方及培养时间进行优化，以期为后续直接利用发酵菌质开发营养及功能食品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草菌株为全虫草，购自华中农业大学菌种试验中心。

大米，湖北国宝桥米有限公司；燕麦，悦联商业管理有限公司；豆粕，石家庄银亿科技有限公司；虫草素，标准品上海源叶生物科技有限公司；喷司他丁标准品，上海麦克林生化科技有限公司；猪胰α-淀粉酶、色谱级乙腈，美国Sigma公司；色谱级甲醇、乙酸铵，美国Thermo Fisher Scientific公司；可消化淀粉及抗性淀粉试剂盒、淀粉葡萄糖苷酶，爱尔兰Megazyme公司；甘氨酸、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等均为食品级。

1.2 仪器与设备

FD5-3P真空冷冻干燥机，美国金西盟公司；KQ-5200 DE超声波清洗器，昆山市超声波仪器公司；3K15高速冷冻离心机，德国 Sigma公司；UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司；LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基配置

马铃薯固体培养基（potato dextrose agar，PDA）：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容至1 L，pH自然。

液体完全培养基（liquid complete yeast medium，LCYM）：葡萄糖 20 g，蛋白胨 2 g，酵母膏 2 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，K2HPO41.00 g，KH2PO40.46 g，加蒸馏水定容至1 L，50 mL分装。

固体发酵培养基：由固体培养料和营养液按一定比例混匀装入罐头瓶，121 ℃灭菌30 min制成。其中，固体培养料又可分为主料和辅料。初始固体培养基包括：80%主料-20 g大米，20%辅料-5 g豆粕，营养液-35 mL LCYM，料液比1:1.4（m/V）。

1.3.2 液体菌种制备

取一菌丝块转接到PDA平板培养基上进行活化，25 ℃恒温培养5 d后，8 mm打孔器打孔，接入50 mL的LCYM培养基，每瓶接种6个菌丝块，25 ℃恒温避光培养5 d。

1.3.3 固体发酵培养

将液体菌种匀浆后按3 mL/罐接种到冷却的固体发酵培养基中，5 ℃避光培养13 d。培养结束后收集发酵菌质，冷冻干燥、粉碎后，检测其eGI值、虫草素和喷司他丁含量。

1.3.4 eGI值的测定

参照文献[26]，采用体外消化法测定蛹虫草发酵菌质eGI值。

1.3.5 虫草素的测定

按照 NY/T 2116-2012[27]高效液相色谱法测定蛹虫草发酵菌质中虫草素的含量。

色谱条件为：色谱柱 Inertsil ODS-SP（C18）柱250 nm×4.6 nm，5 μm；流动相为乙腈-水（5:95），流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，进样量10 μL。

1.3.6 喷司他丁的测定

喷司他丁的测定参考文献稍作修改[28]，取 1.00 g于50 mL容量瓶中，加水约40 mL，超声处理10 min，用水定容，取2 mL样液8000 r/min离心10 min后，将上清液过0.45 μm微孔滤膜，进行高效液相色谱检测。

色谱条件为：色谱柱 Inertsil ODS-SP（C18）柱250 nm×4.6 nm，5 μm，流动相为2.5 g/L乙酸铵溶液-甲醇-乙腈（96:2:2），流速为 1.0 mL/min，柱温为 30 ℃，进样量10 μL，检测波长为282 nm。

1.4 单因素实验设计

在1.3.1的初始固体发酵培养基中，添加一定比例燕麦替代大米作主料，LCYM 中添加甘氨酸作营养液，辅料组成不变，采用单因素实验，对大米和燕麦质量配比、豆粕添加量、营养液中甘氨酸浓度、料液比四个因素进行优化。

1.4.1 大米与燕麦配比单因素试验

在1.3.1的固体发酵培养基中，保持主料总重量为20 g，分别称取质量比值为10:0、9:1、3:7、5:5、7:3、1:9的大米与燕麦作为主料，装入200 mL罐头瓶，辅料与料液比不变配制培养基，灭菌冷却后按1.3.3所述方法接种和培养，制备发酵菌质。

1.4.2 豆粕添加量单因素试验

在 1.3.1固体培养基中，固定固体培养料总量为25 g，调节豆粕添加量分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%，料液比不变，灭菌冷却后按1.3.3所述方法接种和培养，制备发酵菌质。

1.4.3 营养液中甘氨酸浓度单因素试验

在1.3.1固体培养基中，主料和辅料不变，分别配置0、1、4、8、16、20 g/L甘氨酸与LCYM混合营养液，料液比不变，灭菌冷却后按1.3.3所述方法接种和培养，制备发酵菌质。

1.4.4 料液比单因素试验

分别按照 1:0.8、1:1.1、1:1.4、1:1.7、1:2.0比例取新鲜配置的LCYM加入到装有20 g大米、5 g豆粕的200 mL罐头瓶中，混合均匀，灭菌冷却后按1.3.3所述方法接种和培养，制备发酵菌质。

1.5 正交优化实验设计

在单因素的基础上，进行大米与燕麦质量配比（A）、豆粕添加量（B）、营养液中甘氨酸浓度（C）、料液比（D）四因素三水平正交实验（表1），按1.3.3所述方法接种和培养，制备发酵菌质后，测定其 eGI值、虫草素和喷司他丁含量。

表1 L9（34）正交实验因素和水平Table 1 L9(34) factors and levels of orthogonal experimental

1.6 发酵时间的确定

为进一步获得eGI值低、虫草素和喷司他丁含量高的发酵菌质，对优化培养基中蛹虫草菌丝体的最佳培养时间进行优化。设定培养周期为60 d，每3 d取样，测定发酵菌质eGI值、虫草素和喷司他丁含量。

1.7 扩大实验

以500 mL罐头瓶为培养容器，将正交优化所得培养基按等比例扩大（2.5倍）加入罐头瓶中制备固体发酵培养基。将液体菌种匀浆后按7.5 mL/罐接种到冷却后的固体发酵培养基中，在25 ℃避光培养18 d，培养结束后收集发酵菌质，测定eGI值、虫草素和喷司他丁含量。

1.8 数据处理

每个实验3次重复。采用SPSS 25和Origin 8.5软件进行数据差异显著性分析和作图。差异显著水平为p＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 大米与燕麦配比对评价指标的影响

阮元等[29]发现维生素 B1的分解产物对虫草素合成具有促进作用，当添加量为 0.83 g/L的维生素 B1时，发酵液中虫草素的产量最高，较未添加维生素B1的空白组提高了75%。而燕麦中含有丰富的维生素，其中维生素B1较大米的含量高，且与其他谷物（如小麦、玉米、大米）相比，其 GI值较低[30]，因此选用燕麦代替部分大米。由图1可知，随着燕麦比例的增加，发酵菌质eGI值显著降低，虫草素和喷司他丁含量都显著增加（p＜0.05）。结果表明，与大米相比，燕麦确实有利于蛹虫草菌株合成虫草素，这与已有报道一致。刘红等[31]发现选用燕麦与燕麦复合培养基所得子实体中虫草素含量均较高其他培养基；胡景霞等[32]分别以早籼米、小米、玉米、燕麦、小麦这五种谷物为基质，所得谷物发酵菌质中燕麦组虫草素含量最高。当主料中大米与燕麦配比为3:7时，eGI值达到最低为57.25，虫草素含量达到最高为4092.60 mg/kg，喷司他丁含量为601.79 mg/kg，当燕麦在主料中占比超过70%时，eGI值反而升高，这可能是由大米和燕麦淀粉含量与种类差异造成的。因此，选取大米与燕麦配比为3:7进行后续实验。

2.1.2 豆粕添加量对评价指标的影响

豆粕作为辅料为蛹虫草菌种提供氮源，俞海峰[33]选用豆粕、大豆粉、棉籽粉、酵母粉、花生粉及麸皮作为氮源，以发酵液中虫草素含量和菌饼干重为指标，确定豆粕为最适氮源，有利于蛹虫草菌株合成虫草素，因此本研究选用豆粕作为蛹虫草固体发酵培养基辅料。由图2可知，随着豆粕添加量上升，发酵菌质eGI值显著降低，虫草素含量与喷司他丁含量都显著增加（p＜0.05）。当豆粕添加量为20%时，喷司他丁含量达到最高，为561.90 mg/kg，当豆粕添加量为25%时，eGI值达到最低58.57，喷司他丁含量略微下降。综合考虑，选取豆粕添加量为25%进行后续实验。

2.1.3 营养液中甘氨酸浓度对评价指标的影响

甘氨酸作为虫草素的前体物质，有利于蛹虫草菌种合成虫草素[34]。由图3可知，当营养液中甘氨酸浓度为0～8 g/L时，随着甘氨酸浓度升高，eGI值显著降低，虫草素含量与喷司他丁含量都呈上升趋势（p＜0.05）。当营养液中甘氨酸浓度为8 g/L时，eGI值降到最低为56.19，虫草素含量与喷司他丁含量都接近最大值，分别为7009.49 mg/kg、632.78 mg/kg，当甘氨酸浓度继续升高时，虫草素含量与喷司他丁含量的上升趋势变缓。因此，选取营养液中甘氨酸浓度为8 g/L进行后续实验。

2.1.4 料液比对评价指标的影响

营养液为蛹虫草菌种提供营养物质，但过多的营养液使培养基质的透气性与含氧量降低，不利于菌丝的生长[35]。由图4可知，随着营养液的增加，eGI值呈上升趋势，虫草素与喷司他丁含量均呈下降趋势，当料液比为1:1.1时，eGI值达到最低为54.83，虫草素与喷司他丁含量都达到最大值，分别为 4725.65、621.10 mg/kg。因此，选取料液比为1:1.1进行后续实验。

表2 L9（34）正交实验结果Table 2 Results of L9(34) orthogonal experimental

2.2 正交实验结果

采用L9（34）正交实验优化培养配方，正交实验结果见表2。由极差分析可知，四个因素对eGI值和虫草素含量的影响顺序为 B＞D＞A＞C，对喷司他丁含量的影响顺序为 B＞A＞D＞C，表明豆粕添加量对三个评价指标都具有重要影响。其中 eGI值最优组合为A3B3C3D3，虫草素和喷司他丁含量的最优组合均为A3B3C2D1。差异显著性分析发现，甘氨酸浓度在 C2和C3水平时虫草素含量及喷司他丁含量差异不显著，此外，考虑料液比D对三个评价指标的综合影响，选择 A3B3C3D1为发酵培养最优配方，即大米与燕麦配比为4:6作主料占70%，豆粕30%，营养液中甘氨酸浓度为10 g/L，料液比为1:0.9。以此配方进行蛹虫草固体发酵，25 ℃培养13 d后所得到的发酵菌质eGI值为53.81，达到低GI水平；虫草素含量为8656.04 mg/kg，喷司他丁含量为776.62 mg/kg。

2.3 发酵时间的确定

发酵菌质的 eGI值、虫草素和喷司他丁含量在0～60 d期间的变化趋势如图5所示，eGI值在0～12 d内显著下降（p＜0.05），在12～60 d期间略微上升，可能是由于虫草菌丝持续生长对发酵菌质中淀粉种类的比例产生了变化。发酵菌质的虫草素在0～60 d培养周期内，随着发酵时间的增加不断累积，到18 d时达到峰值，其后随着培养时间的延长含量基本稳定，这一现象与Wen等[36]的报道类似，他们发现蛹虫草子实体中虫草素含量在15～60 d内快速上升，当到达一定数值后，虫草素含量基本稳定。而发酵菌质中喷司他丁含量变化趋势与虫草素的有所不同，在0～18 d培养期内，随着培养时间的延长，喷司他丁含量逐渐增加，在第18 d达到峰值，其后逐渐下降，并在第36 d时基本稳定。目前并无不同培养时间蛹虫草中喷司他丁含量的报道，因此出现此现象的原因还有待进一步研究。综合三个指标确定最佳发酵时间为18 d，此时发酵菌质中虫草素和喷司他丁含量分别为12161.28 mg/kg、1033.23 mg/kg。

2.4 扩大验证实验结果

为验证本研究所获得培养基配方和培养时间的有效性，在500 mL罐头瓶中接种蛹虫草菌丝培养18 d后，测定发酵菌质 eGI值为 53.86，虫草素含量为12204.55 mg/kg，喷司他丁含量为1021.48 mg/kg。扩大验证实验结果与优化试验中所得结果差异不显著，表明本研究所得培养基和培养时间是可靠的，可应用于蛹虫草发酵菌质的规模生产中。

3 结论

本研究以燕麦部分替代大米为主料，豆粕为辅料，LCYM添加甘氨酸为营养液，通过单因素和正交优化实验确定了蛹虫草固体配方为：配比为4:6的大米和燕麦用量占70%，豆粕添加量为30%，含10 g/L甘氨酸的LCYM培养基作营养液，料液比为1:0.9。经过60 d发酵周期，确定出最佳培养时间为18 d。最终经过扩大实验在25 ℃避光培养18 d，所得发酵菌质eGI值由65.86下降到53.86，达到了低GI水平；虫草素含量为 12204.55 mg/kg，喷司他丁的含量为 1021.48 mg/kg，与初始配方相比，虫草素含量增加了348.13%，喷司他丁含量提高了81.79%，为后续低GI功能食品的研发奠定基础。