中药治疗肺结核的用药规律及其核心药物作用机制的探讨

刘媛 陈洁 孙辉 刘幸 刘梦醒 李池川 杨柏荣 杨敏

肺结核属于中医“肺痨”“痨瘵”范畴，中医治疗肺结核历史悠久，目前应用广泛的有八珍散、血府逐瘀汤、芩桂术甘汤、结核丸等经典方及多个验方[1]。中药在肺结核的治疗上有着显著的临床疗效，积累了大量的临床数据。但中医治疗肺结核至今仍缺乏大规模的数据整理，没有充足的现代科学理论支撑。此外，中药复方由君臣佐使多种药物构成，配伍灵活，且中药成分复杂，使得中药治疗肺结核的机制十分复杂，有待进行更深入的探究。

数据挖掘是运用现代信息技术对已有数据进行处理，探索用药规律，最终反馈于临床，帮助靶向治疗疾病，目前已有诸多学者将其应用于中药领域[2]。网络药理学可为中药多成分、多靶点、多环节、整体网络等多角度的研究提供技术支撑，有利于从分子生物学网络视角揭示中药的作用机制，阐明其科学内涵[3-5]。中国在肺结核防治等方面的临床数据呈几何级数增长，借助数据技术手段能有效利用这些临床数据。本研究通过数据挖掘归纳治疗肺结核的中药复方，分析用药规律，寻找治疗肺结核的核心药对。并借助网络药理学的方法，筛选核心药对治疗肺结核的潜在靶点，通过基因本体论(gene ontology，GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG)通路富集分析，探究核心药对治疗肺结核的关键靶点及作用机制，为临床应用及后期组方用药提供新的思路及理论依据。

资料和方法

一、数据挖掘

1. 数据来源：检索万方、中国知网、维普、PubMed等数据库2014年1月至2021年2月的文献，以“肺结核”“肺痨”“临床”“中药”“中医”“pulmonary tuberculosis” “pulmonary” “medicine” “traditional Chinese medicine”等为关键词，排除综述文献、重复文献、干预措施不符合的文献，由双人负责数据的审核，确保数据的准确性。最终纳入文献156篇，处方206个。

2. 数据收集：采用双人核对模式录入原始数据，参照《中华人民共和国药典》[6]和《中药学》[7]将文献中出现的药物名称进行规范，同时对数据进行预处理，建立原始数据库。

3. 数据分析：应用IBM SPSS Statistics 21.0软件对数据进行频次分析，统计高频药物，初步分析肺结核的用药规律。运用IBM SPSS Modeler 14.1软件进行药物关联规则分析，设置最低支持度为10%，最小规则置信度为60%，最大前项数为5，挖掘核心药物群。

二、网络药理学

通过中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，筛选核心药对的化学成分，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为条件，筛选建立核心药对的化学成分及其作用靶点蛋白数据库。使用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)以“pulmonary tuberculosis”为关键词，检索出肺结核的潜在靶点，并利用Venny 2.1软件将药物靶点与疾病靶点进行映射，获得核心药对治疗肺结核的潜在作用靶点。利用String 11.0数据库(https://string-db.org/)构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络模型。将String 11.0数据库中的保留节点(node1和node2)和结合率评分(combine score)信息，并导入到Cytoscape 3.7.0软件，分析靶点相关的拓扑参数。通过DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov)将潜在作用靶点进行GO功能富集分析，分析包括生物过程(biological process)、细胞组成(cellular component)、分子功能(molecular function)，以错误发现率(false discovery rate)≤0.05为阈值，将其按-log(P)值升序进行排序，对排名前15的结果进行可视化处理。将潜在作用靶点导入Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html)进行KEGG通路富集分析。基于药物-成分-靶点-信号通路，将上述得到的核心靶点和KEGG通路富集分析的结果所选取的主要信号通路建立联系，并与“成分-靶点”间相互作用关系整合并导入Cytoscape 3.7.0软件中，从而得到成分-靶点-信号通路网络图。

结 果

一、基于用药频数的组分规律分析

经过整理，共纳入206个处方，涉及中药272味，总频次为2657次。频次排名前5位的中药为百部、麦冬、黄芪、白及、地黄，涉及化痰止咳平喘药、补虚药、止血药、清热药等，符合肺结核中医常见证候(肺阴虚、阴虚火旺、气阴两虚)的治法[8]。详见表1。

二、基于关联规则的组分规律分析

关联规则分析结果显示，白及-百部关联性支持度最高，与其他高频药物的关联均较为紧密，且用药频率最高，提示“白及-百部”为治疗肺结核的核心药对。详见表2，图1。

表2 治疗肺结核频数前20位中药的关联规则

图1 治疗肺结核频数前20位中药的关联规则图

三、白及-百部药对所含化学成分筛选及靶点预测

通过TCMSP数据库检索核心药对“白及-百部”的化学成分，筛选得到41个化学成分，其中白及9个化学成分，百部32个化学成分。共预测到靶基因113个。各有效成分的口服生物利用度和类药性值见表3。

表3 白及-百部有效化学成分

续表3

四、肺结核相关靶点的筛选

从数据库中检索获得治疗肺结核的靶点1675个。根据经验设定评分大于中位数的目标靶点为肺结核的潜在靶点，评分最大值为66.73，最小值为0.17，中位数为2.78，故设定评分>2.78的靶点为肺结核的潜在靶点，最终得到837个相关靶点。

五、白及-百部药对治疗肺结核潜在靶点预测

通过VENNY2.1软件将白及-百部化学成分靶点与肺结核靶点进行映射，获得核心药对治疗肺结核的潜在作用靶点30个。见图2。

注 左侧代表白及-百部化学成分靶点；右侧代表肺结核靶点；重叠部分为共同靶点图2 白及-百部药对靶点与肺结核靶点韦恩图

六、白及-百部药对治疗肺结核的PPI网络构建

使用String数据库对白及-百部治疗肺结核潜在靶点进行靶标蛋白的PPI网络构建，见图3。有6个靶点因为没有与网络相联系，故剔除。其中得分前10位的靶点基因分别为CASP8、FAS、CASP3、BCL2、MAPK14、JUN、CASP9、NR3C1、PPARG、SIRT1，表明这些靶点在白及-百部药对治疗肺结核的作用机制中具有重要意义。

图3 白及-百部药对治疗肺结核的PPI网络图

七、白及-百部药对治疗肺结核靶点的GO和KEGG通路富集分析

GO分析结果显示，生物过程主要涉及缺乏配体的外源性凋亡信号通路(extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand)、对药物的反应(response to drug)、RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、凋亡过程(apoptotic process)等。细胞组成主要包括死亡诱导信号复合体(death-inducing signaling complex)、细胞核(nucleus)、线粒体外膜(mitochondrial outer membrane)、细胞质(cytosol)等。分子功能主要涉及酶结合(enzyme binding)、蛋白结合(protein binding)、参与细胞凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process)等。见图4。

图4 白及-百部药对治疗肺结核作用靶点的GO分析结果

为进一步探究白及-百部药对治疗肺结核在生物信号通路层面的机制，将潜在作用靶点与KEGG通路进行映射，根据P值筛选出排名前20的通路，分别为癌症相关通路(pathways in cancer，14个靶点)、乙型肝炎(hepatitis B，10个靶点)、结核病(tuberculosis，10个靶点)、大肠癌(colorectal cancer，7个靶点)、凋亡(apoptosis，6个靶点)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway，8个靶点)、TNF信号通路(TNF signaling pathway，6个靶点)等。具体分析结果见图5。

图5 白及-百部药对治疗肺结核作用靶点的KEGG富集分析结果

由上述KEGG富集结果分析可知，白及-百部药对在结核病通路上的主要作用靶点为CASP8、BAX、BCL2、CASP9、CASP3、IL10、NOS2、MAPK14、RAF1、TGFB1，这表明白及-百部药对可能通过影响细胞凋亡、宿主免疫等发挥治疗肺结核的作用。见图6。

注 粉色代表白及-百部活性靶点；绿色代表白及-百部非活性靶点图6 结核病信号通路

八、白及-百部药对成分-靶点-信号通路构建

运用Cytoscape 3.7软件构建“白及-百部”药对成分-作用靶点-代谢通路网络。图中包括白及和百部化学成分41种；白及-百部治疗肺结核潜在靶点24个；信号通路20条。筛选出白及-百部化学成分的作用靶点分布在不同的信号通路，相互协调，通过调控不同的信号通路发挥治疗肺结核的作用，结果见图7。成分-靶点-信号通路网络显示，预测出白及-百部治疗肺结核的41种潜在活性成分与CASP8、BAX、BCL2、CASP9、CASP3、IL10、NOS2、MAPK14、RAF1及TGFB1等靶点存在较强的相互作用，通过KEGG富集分析显示这些靶点主要集中在癌症、乙型肝炎、结核病、凋亡、MAPK、TNF等相关信号通路(P值均<0.01)。白及-百部药对成分-靶点-信号通路图体现了中药通过多成分-多靶点-多途径治疗疾病的特点。

注 左侧图内侧为白及-百部有效成分，外侧为靶点；右侧图为通路图7 白及-百部治疗肺结核成分-靶点-信号通路

讨 论

肺结核属于中医学“肺痨”范畴，《黄帝内经·素问》记载：“大骨枯槁，大肉陷下，胸中气满，喘息不便，内痛引肩颈，身热”。华佗《中藏经·传尸》记载“钟此病死之气，染而为疾，故曰传尸也”[9]。中医治疗肺结核历史悠久，具有显著优势。中药治疗肺结核具有增强机体抗病能力、调节免疫功能、减毒增效等优势，但鲜有研究报道治疗肺结核的中药组方用药规律分析。其次，中药的有效成分及中药作用的“靶点”研究不甚明确，中药治疗耐药肺结核的作用机制需要进一步深入研究。

本研究检索自2014年以来中药治疗肺结核的临床文献，通过对使用中药进行频数分析，发现使用频数较高的中药为百部、麦冬、黄芪、白及、地黄，涉及化痰止咳平喘药、补虚药、止血药、清热药等。中医认为肺结核的病位为肺，肺主宣发与肃降，肺的功能失常，则水湿内停，聚而成痰，配伍化痰止咳药以化痰降气益肺。肺结核的病机多为阴虚、气虚、血虚，兼有内燥、痰咳，因而运用补益气血、养阴生津，兼用疏风清热、宣肺止咳之药。通过关联规则分析以期寻找关联性最高的核心药对，综合各项指标后选择“白及-百部”为中药治疗肺结核的核心药对。其次为“地黄-麦冬”“百部-麦冬”“百部-黄芪”“麦冬-黄芪”，提示临床用药时应注重白及、百部、地黄、麦冬、黄芪等药物之间的配伍。临床常用白及、百部治疗咳喘、慢性支气管炎、肺结核等疾病。研究显示，白及、百部对肺结核患者肺空洞及痰菌阴转具有显著疗效，特别是咯血患者，能明显缩短咯血时间[10-12]。

运用网络药理学方法进一步探究核心药对“白及-百部”治疗肺结核的作用机制。通过TCMSP数据库共筛选出41个活性成分及113个靶点，与肺结核疾病靶点映射后，得到交集靶点30个。KEGG通路富集结果表明，白及-百部治疗肺结核预测靶点主要富集在结核病、癌症、乙型肝炎、大肠癌、凋亡、MAPK、TNF等相关信号通路上，这些通路与肺结核的其他相关研究相似，侧面证明了本研究的可靠性[13]。通过以上分析，本研究预测“白及-百部”治疗肺结核的作用机制可能是通过作用于结核病通路上的Caspase-8(CASP8)、BAX、BCL2、CASP9、CASP3、IL10、NOS2、MAPK14、RAF1、TGFB1等关键靶点发挥疗效。

Caspase家族作为一种半胱天冬蛋白酶，在凋亡的信号转导和效应过程中起重要作用。在肺结核的关键通路巨噬细胞/树突状细胞通路中，CASP8通过特异性Caspase裂解位点处裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活。CASP8还参与了Bcl-2家族成员Bid的切割。切割后的Bid易位到线粒体，在那里它与Bcl-2家族成员Bcl-2(一种抗凋亡蛋白)和Bax(一种促凋亡蛋白)相互作用，介导细胞色素C(cytochrome c)的释放和Caspase-9的激活。通过以上两条途径作用于Caspase-3蛋白，执行剪切细胞结构蛋白的作用，直接使细胞发生凋亡[14-16]。T细胞介导的免疫应答也是结核分枝杆菌感染的重要因素，IL-10作为Th2型细胞因子，与肺结核的易感性相关。IL-10的存在导致了抗原呈递替代处理途径的缺失，并下调来自健康个体的单核细胞和巨噬细胞的共刺激分子表达，从而损害细菌清除和诱导长期的肺结核感染[17-18]。结核分枝杆菌诱导的肺泡巨噬细胞能够产生TNF-α和IL-1β，这些细胞因子与T细胞产生的IFN-γ可以通过一氧化氮合酶的作用诱导产生一氧化氮[19-20]。有研究表明，结核病患者肺泡巨噬细胞表达的NOS2具有潜在的杀死结核分枝杆菌的能力，而且这种NOS2在体外可以杀死结核分枝杆菌[21]。中性多形核白细胞是宿主抵御外界病原体的第一道防线，TLR 2参与了结核病患者外周血中性粒细胞PMN凋亡，P38(又名MAPK14)蛋白激酶与可作用于Toll样受体的信号传导[22]。Raf-1是一组异质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是参与正常细胞生长和致癌转化的许多信号通路的核心成分。Raf-1磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(MEK)，进而激活丝裂原活化的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERKs)，导致信号的传播。Raf-1-MEK-ERK级联调节多种细胞过程，如增殖、分化和凋亡[23]。有研究表明，结核分枝杆菌与树突状细胞相互作用以激活Raf-1-乙酰化依赖性信号传导途径，从而调节不同TLR的信号传导，参与结核分枝杆菌的适应性调节[24]。另有研究表明，小儿肺结核患者的外周血单个核细胞中RAF1的mRNA和蛋白水平上调[25]。转化生长因子TGF-β是免疫稳态和免疫耐受的重要促进因子。肺结核治疗后肺纤维化患者TGF-β水平明显升高[26]，抗TGF-β抗体与抗逆转录病毒治疗相结合可能增强T细胞功能，促进免疫系统有效清除结核分枝杆菌[27]。

本研究将数据挖掘与网络药理学方法相结合，整合中药治疗肺结核的临床大数据规律，挖掘出核心药对“白及-百部”，借助网络药理学手段揭示核心药对潜在关键靶点、通路及它们的相互作用。本研究将有助于揭示中医药治疗肺结核的科学内涵，为结核病的治疗机制提供思路。