头花蓼对幽门螺杆菌刺激骨髓来源巨噬细胞炎症反应的作用及机制*

袁蕴馨， 简单， 张姝，， 何芸， 孙朝琴，， 黄健， 莫非，**

(1.贵州医科大学 医学检验学院， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附属医院 临床检验中心， 贵州 贵阳 550004)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一种定植于人胃黏膜的革兰阴性螺旋杆菌。据报道，世界范围内H.pylori感染率高达50%，且呈逐年上升的趋势[1]。H.pylori在人体内通常难以清除，H.pylori长期感染是引起慢性胃炎、消化性溃疡及胃腺癌等胃肠道疾病的原因之一[2]，1994年H.pylori被世界卫生组织列为一级致癌物[3-4]。NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein3，NLRP3)炎症小体是一种细胞内蛋白复合体，主要在固有免疫细胞中表达，如单核细胞和巨噬细胞[5]。NLRP3炎性小体作为固有免疫的重要组分，在机体免疫反应中发挥着关键作用[6]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)严格监管NLRP3在转录水平上的表达，激活NF-κB信号通路，能够使在未激活的巨噬细胞中低表达的NLRP3的表达增加；另外，活化的NLRP3可激活天冬氨酸蛋白水解酶 1(caspase-1)，活化的caspase-1继而促进无活性的炎症因子白细胞介素-1β(interleukin-1beta，IL-1β)前体和IL-18前体的加工，形成成熟的IL-1β和IL-18释放入体内，促进炎症反应、应激反应等生物学效应的发生[7-8]。在由细胞因子介导的H.pylori感染相关的炎症反应的研究中发现，IL-1β和IL-18在H.pylori感染的胃黏膜中的分泌明显增加[9-10]。此外，NLRP3不仅能被机体内产生的内源性物质或某种细胞状态的变化所激活，也可以捕捉病毒、细菌等病原微生物入侵的“危险信号”[11-12]。研究表明，H.pylori空泡毒素VacA可促进胃上皮细胞NLRP3炎性小体的激活，H.pylori的感染与NLRP3炎症小体的活化密切相关[13]。因此，NLRP3炎症小体可能成为H.pylori相关性胃炎提供新的治疗靶点。头花蓼(Polygonumcapitatum, PC)是一种具有贵州地方特色的民族药，因其具有抗菌、抗炎、清热及利湿等功效被广泛使用[14-15]。本课题组前期研究表明，PC可显著降低H.pylori在胃黏膜的定植率，同时可缓解H.pylori引起的小鼠胃黏膜炎症反应，减轻其导致的胃炎等疾病[16]，但PC是否能够通过影响NF-κB/NLRP3/IL-1β信号通路发挥作用尚未见研究报道。鉴于H.pylori感染引起的是全身性炎症反应，本研究以骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)为研究对象，观察PC对H.pylori刺激后的BMDMs细胞模型中NF-κB/NLRP3/IL-1β信号通路的影响，以期发现新的PC作用靶点，为其临床应用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株及菌株 BMDMs购自青旗(上海)生物技术发展有限公司，H.pyloriSS2000由中国疾病控制中心传染病所张建中研究员惠赠。

1.1.2主要药物、试剂及仪器 PC浸膏粉(贵州威门药业)；酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(欣博盛生物)，抗鼠IL-1β抗体(美国 Cell Signaling Technology)，抗兔NF-κB /p65 抗体和抗兔NLRP3抗体(英国 Abcam)；三气培养箱(美国Thermo Fisher Scientific)，Western blot电泳及转膜系统和酶标仪(英国Bio-Rad)，低温离心机(美国Beckman)，紫外分光光度计(日本SHIMADZU)。

1.2 实验方法

1.2.1H.pylori复苏、培养及鉴定 从-80 ℃冰箱中取出含H.pyloriSS2000菌株的冻存管，室温下溶解，用移液器将含菌冻存液转移至哥伦比亚血琼脂平板内，平板放入37 ℃的5%O2、10%CO2、85%N2及95%相对湿度的三气恒温培养箱中培养48 h待用；观察H.pylori生长状况，稳定传代3次后进行革兰染色、触酶试验、快速尿素酶试验和氧化酶试验，以鉴定H.pylori。

1.2.2细菌-细胞共培养模型的建立及分组 收集处于指数生长期的BMDMs，于培养皿中加无血清高糖(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)培养基，饥饿培养4 h；收集H.pylori，使用含10%胎牛血清无双抗高糖DMEM培养基将其配制成均匀菌液，紫外分光光度计测定菌液D600值，计算菌液浓度并将菌液稀释至3.0×105CFU/L。用四甲基偶氮唑盐比色法(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)试剂盒，检测H.pylori对BMDMs细胞的影响。按照不同感染复数(multiplicity of infection，MOI；细菌数 ∶细胞数)分为空白、25 ∶1、50 ∶1、100 ∶1、200 ∶1、400 ∶1，96孔板中培养各组细胞12 h，加0.005 g/L MTT 20 μL，培养4 h，吸出培养液，加二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μL，室温震荡溶解结晶，使用酶标仪检测D450值。

1.2.3细胞上清液中IL-18和IL-1β的表达 以MOI分别为空白、25 ∶1、50 ∶1及100 ∶1的比例置于三气培养箱中培养12 h，加H.pylori菌液刺激，培养3、6、12及24 h，倒置显微镜下观察H.pylori感染的BMDMs的细胞形态，收集各时间的培养上清液及细胞， ELISA检测细胞上清液中IL-18和IL-1β的表达水平，根据ELISA试剂说明书，并严格按照实验操作步骤进行操作，向各孔中加反应终止液100 μL，混匀并立即测量D450值，绘制标准曲线，计算各孔中IL-18和IL-1β的含量。

1.2.4PC治疗模型的建立及分组 将BMDMs分为空白组、模型组及PC治疗组，模型组和PC治疗组中加H.pylori，以MOI为100 ∶1刺激12 h；PC治疗组BMDMs中药物终质量浓度根据本课题组前期研究结果确定，以0.08 μg/L PC处理48 h[17]；空白组和模型组BMDMs给予等量DMEM培养基培养48 h。

1.2.5NF-κB单体p65(NF-κB/p65)、NLRP3、IL-1β前体(IL-1β precursor，Pro-IL-1β)及IL-1β蛋白的表达 收集空白组、模型组及PC治疗组BMDMs，使用PBS洗涤3次，加含1%苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的蛋白裂解液(RIPA lysis buffer, RIPA)，冰上裂解30 min，12 000 r/min于4 ℃离心10 min，取上清液，采用蛋白定量(bicinchoninic acid assay，BCA)法对其进行蛋白定量；根据胞浆、胞核蛋白提取试剂说明书，对空白组、模型组及PC治疗BMDMs的细胞核和细胞质的蛋白进行提取，使用BCA法定量；总蛋白以β-actin为内参蛋白，核蛋白以LaminB为内参蛋白；向蛋白样品加SDS loading buffer，100 ℃煮沸10 min，行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)；200 mA恒流冰浴电泳转膜1.5 h，打开转移夹，肉眼可见清晰的Marker转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上；使用杂交膜清洗液(TBS with tween-20，TBST)漂洗后放于封闭液中，室温震荡封闭2 h；加相应抗体孵育；凝胶成像仪中曝光采集图像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞增殖

MTT比色法结果显示，当MOI高于100 ∶1时，细胞抑制率增高，BMDMs的数量减少(P<0.05)。见图1。

图1 H.pylori对BMDMs细胞增殖的影响Fig.1 Effect of H.pylori on BMDMs cell proliferation

2.2 H.pylori感染的细胞形态

倒置显微镜下观察BMDMs形态，结果表明，空白组细胞丰满呈梭形、表面光滑、颗粒物质少，模型组BMDMs多数变圆、表面不光滑、颗粒物质明显增多。见图2。

空白组 模型组图2 H.pylori感染的BMDMs细胞形态(未染色镜检，×100)Fig.2 Cellular morphology of H. pylori infected-BMDMs(unstained samples under microscopic examination，×100)

2.3 IL-1β和IL-18的表达

ELISA结果显示，经H.pylori刺激后，BMDMs中IL-1β 和IL-18的表达水平增高，与H.pylori呈明显的浓度依赖性；当MOI为100 ∶1且作用于DMEMs 12 h时，IL-1β 和IL-18的表达水平达到峰值，且高于空白组(P<0.05)。见图3。

注：A、B为不同细菌与细胞比例下IL-1β、IL-18浓度；C、D为不同感染时间下IL-1β、IL-18浓度；(1)与细菌与细胞比例0组或感染时间3 h组比较，P<0.05。图3 H.pylori感染BMDMs的共培养模型中 IL-1β和IL-18的表达Fig.3 The expression levels of IL-1β and IL-18 in BMDMs cocultured with H. pylori

2.4 NF-κB/p65的表达

与空白组相比，模型组BMDMs细胞质内NF-κB/p65蛋白表达减少、细胞核内NF-κB/p65蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，PC治疗组BMDMs细胞质内NF-κB/p65蛋白表达升高、细胞核内NF-κB/p65蛋白表达减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A为Western blot检测NF-κB/p65表达，B、C为NF-κB/p65的蛋白定量结果；(1)与空白组比较，P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05。图4 各组BMDMs细胞质和细胞核中NF-κB/p65蛋白表达Fig.4 NF-κB/p65 expression levels in the cytoplasm and nuclei of BMDMs in each group

2.5 NLRP3、IL-1β及Pro-IL-1β蛋白的表达

研究结果显示，与空白组相比，模型组BMDMs中NLRP3、IL-1β蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，PC治疗组BMDMs中NLRP3、IL-1β蛋白表达减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；各组BMDMs中 Pro-IL-1β蛋白表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图5。

注：A为IL-1β、Pro-IL-1β、NLRP3的Western blot检测结果；B、C、D为IL-1β、Pro-IL-1β、NLRP3蛋白的定量结果；(1)与空白组相比，P<0.05；(2)与模型组相比，P<0.05。图5 各组BMDMs中 NLRP3、IL-1β及Pro-IL-1β 蛋白的表达Fig.5 Proteins expression levels of NLRP3, IL-1β, and Pro-IL-1β in BMDMs in each group

3 讨论

H.pylori是一种革兰氏阴性螺旋状杆菌，通常定植于人体的胃黏膜和十二指肠黏膜，是胃炎的主要致病因子，其引起的炎症反应可进一步发展为胃黏膜肠化生，甚至癌变[18-19]。H.pylori在全球范围内广泛传播，我国H.pylori总感染率达56.22%[20]。在西医上，H.pylori的治疗主要采用质子泵抑制剂(铋剂)联合两抗生素的三联或四联疗法，但由于抗生素的广泛使用，使得H.pylori对抗生素的耐药性增强，根除率逐年下降[21]。因此，寻求新的治疗H.pylori感染的方法成为亟待解决的问题。

PC作为“十大苗药产业链”之一，具有清热解毒、活血化瘀等多重疗效，临床上可用于治疗泌尿系统疾病[22]。有研究表明，PC的水提物显示出良好的抗菌、抗炎效果，具有进一步开发应用的前景[17]；本课题组前期研究也表明，PC能够抑制H.pylori生长，调节细胞周期，可对H.pylori胃炎小鼠进行免疫调节，并抑制其胃肠激素的紊乱，改善内环境[23]。

本研究结果显示，当MOI为100 ∶1时，且作用于DMEMs 12 h时，IL-1β和IL-18的产生达到最大值；当MOI高于100 ∶1时，H.pylori可抑制BMDMs的增殖，这表明当H.pylori达到一定浓度时，其会对BMDMs细胞产生一定的细胞毒性，影响其正常生长。倒置显微镜下观察细胞形态发现，空白组BMDMs细胞丰满呈梭形、表面光滑、颗粒物质少，H.pylori感染后大多数细胞变圆、表面不光滑、颗粒物质明显增多，提示H.pylori感染可引起BMDMs细胞的形态发生改变，这可能是H.pylori突破BMDMs细胞的细胞屏障，在细胞内生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物进而损伤BMDMs细胞造成的。

NLRP3是一种细胞内蛋白复合物，与多种慢性炎症相关。有研究表明，H.pylori能够活化NLRP3炎症小体，并进一步诱导中性粒细胞分泌成熟的IL-1β[24]。作为炎症反应的关键因子，NLRP3在H.pylori引起的慢性炎症中扮演着重要的角色。Li等[25]研究显示，H.pylori可通过活性氧(reactive oxygen species，ROS)信号通路激活NLRP3炎症小体，诱导人单核细胞系产生IL-1β和IL-18；另外有研究表明，中药可通过抑制NLRP3等炎症因子的活化控制病情[26]；Choi等[27]研究表明，查尔酮衍生物可通过抑制白细胞介素-1受体激活的激酶4 (interleukin-1 receptor-activated kinase 4 ，IRAK4)/核因子抑制蛋白-α(inhibitor of NF-κB-α，IκBα)/NF-κB信号通路阻断H.pylori引起的NLRP3炎症小体的激活，抑制IL-1β、IL-18及caspase-1的产生，从而减轻炎症反应；Lian等[28]研究结果显示，广藿香醇能抑制H.pylori引起的单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等促炎因子的分泌，且经广藿香醇作用后，NLRP3的表达水平较模型组明显降低，因此其机制可能与抗氧化活性、抑制促炎因子的分泌和调节NLRP3炎症小体功能有关。

在本研究中，经PC作用后，与模型组相比，PC治疗组BMDMs细胞浆内NF-κB/p65蛋白表达升高，细胞核内NF-κB/p65蛋白表达减少，表明PC可抑制由H.pylori引起的NF-κB/p65核内转移，且可抑制炎症反应中NLRP3、IL-1β及IL-18的表达上调，因此有理由认为PC可通过调节NF-κB/NLRP3/IL-1β信号通路在H.pylori胃炎中发挥治疗作用。