LED蓝光光疗对黑色素合成的作用及机制

杨 莹， 贾冰怡， 张锡梅， 吕金鹏， 宋国强

(常州大学 药学院， 江苏 常州 213164)

人类皮肤色素合成十分复杂，在黑色素的合成过程中酪氨酸酶(TYR)的作用最为重要，是黑色素合成过程中的限速酶[1]。酪氨酸酶氧化羟化酪氨酸得到多巴醌[2-3]，多巴醌被进一步合成为褐黑素和多巴色素。大部分多巴色素经过多步催化形成黑色真黑素，少部分催化形成棕色真黑素，人体不同肤色也由此而来。

LED光疗广泛应用于皮肤领域。光的波长不同，人体皮肤受影响的程度不同。人体组织将光能吸收后，进一步转化为各种形式的能，从而引发体内一系列的物理和化学变化[4]。

当前主要有LED红、黄、蓝光3种光源。红光(630～650 nm)光疗、黄光(570～590 nm)光疗通过诱导皮肤新胶原的合成，降低基质金属蛋白酶的表达[5]，可起到嫩肤的作用。红光还可通过降低局部PEG-2起到抑制炎症的作用[6-8]。蓝光(400～450 nm)可用于治疗痤疮。痤疮丙酸杆菌会合成并储存内源性卟啉，这是一种内源性的光敏剂，暴露于蓝光下[9-11]，受光能激发后转为高能量不稳定的卟啉，与三态氧结合形成不稳定的单态氧，诱导细菌死亡。蓝光光疗在临床上还用于促进白癜风病人的色素合成，但其机制尚未明确。在黑色素的合成和代谢中，MAPK信号通路家族极为重要[12]，其中包括ERK1/2，JNK和p38，可通过Western blot检测ERK1/2，JNK和p38的表达以及磷酸化水平。有报道指出选用B16F10细胞进行LED红光处理[13-15]，可降低Mitf和酪氨酸酶(TYR)的表达，并发现ERK磷酸化触发Mitf降解[16]，最终减少了黑色素的合成[17-19]。因此本课题设计实验探讨LED蓝光光疗对小鼠皮肤黑色素瘤细胞(B16F10)黑色素合成的影响并研究相关机制。

1 实验部分

1.1 实验材料

DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(gibco，美国)、B16F10 小鼠黑色素瘤细胞系(中国科学院上海细胞所，中国)、磷酸盐缓冲液(Biofroxx，德国)、BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天生物有限公司，中国)、β-actin抗体、TYR抗体、p-ERK/ERKMTS抗体、p-p38/p38抗体(Abcam，美国)、Masson-Fontana黑色素胺银染色试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，中国)。

二氧化碳细胞培养箱(Sanyo，日本)、多功能酶标仪(BioTek，美国)、化学发光成像仪(Tannon，中国)。

1.2 细胞培养

1.2.1 细胞复苏

从-80 ℃冰箱中取出B16F10 黑色素细胞，于37 ℃水浴中快速摇晃至完全溶解。取15 mL离心管，加入全部悬液和10倍以上的高糖培养基(其中含10% FBS)。以1 000 r/min，离心3 min。取离心后沉淀，加入含10%FBS的高糖培养基，反复吹打。取一培养皿，加入全部细胞悬液，静置于恒温培养箱中(37 ℃，5% CO2)培养。

1.2.2 细胞培养

将生长至80%的复苏细胞传至3代以上，进行给药实验。为研究LED蓝光剂量与黑色素降解的相互关系，将细胞分为对照组、LED蓝光光疗处理组(1，5，10，20，40，50，60 J/cm2)。进一步研究LED蓝光光疗影响黑色素降解的具体机制，选取同一LED蓝光光疗照射强度(40 J/cm2)，处理细胞的时间分别为0，30，60，120，180，360 min。

1.3 MTT法测定细胞活力

取一个96孔板，消化处于生长细胞对数期的B16F10细胞并种板，每板用6孔，每孔200 μL细胞悬液(含10% FBS)，细胞浓度为 1×105个/mL，静置培养24 h。显微镜下观察细胞贴壁后，进行LED蓝光光疗处理。吸出上层液体，每孔加入2 mL无菌1× PBS，进行不同强度的LED蓝光光疗照射(1，5，10，20，40，50，60 J/cm2)。照射结束后吸出PBS，加入含2.5% FBS的DMEM培养基，静置培养24 h。用同样的方法照射3次，最后一次照射结束后静置培养24 h。吸出孔中液体，每孔加入110 μL的混合溶液(V(DMEM)∶V(MTT)=10∶1)，于37 ℃的培养箱中恒温培养4 h。吸出上层液体，每孔加入150 μL的DMSO，摇床振摇10 min。于多功能酶标仪中测定每孔的吸光度值(波长570 nm)，并计算细胞相对抑制率。

1.4 NaOH 裂解法测定黑色素含量

取一个6孔板，消化处于生长细胞对数期的B16F10细胞并种板，每孔2 mL细胞悬液(含10% FBS)，细胞浓度为1×105个/mL，于恒温培养箱(37 ℃，5% CO2)中静置培养24 h。显微镜下观察细胞贴壁后，进行LED蓝光光疗处理。吸出孔中上层液体，每孔加入2 mL无菌1× PBS，进行不同强度的LED蓝光光疗照射(1，5，10，20，40 J/cm2)。照射结束后吸出PBS，加入培养基(含2.5% FBS)，静置培养24 h。照射3次，最后一次照射结束后静置培养24 h。吸出上层液体，PBS冲洗两次，于冰上裂解20 min，刮下细胞于1.5 mL离心管中，离心(4 ℃，13 000 r/min，15 min)。吸出上清液于另一离心管中，4 ℃保存。向每支沉淀离心管中加入100 μL 0.1% NaOH裂解液，吹打均匀后于金属浴中加热(80 ℃，1 h)，涡旋。将混合液加入96孔板，每孔20 μL，每个样品制备3个复孔，在多功能酶标仪中测定每孔的吸光度值(波长405 nm)。

1.5 Masson-Fontana 黑色素胺银染色

选用10%甲醛水溶液进行固定，提前接种细胞于玻片并进行LED光疗处理。将玻片置于蒸馏水中，取出后加入Fontana 氨银溶液，避光浸染12～24 h。蒸馏水反复冲洗(5，6次为宜)。选用硫代硫酸钠溶液处理 1～5 min，蒸馏水处理3～5 min，加入中性红染色液，复染5 min，蒸馏水冲洗，95% 乙醇、无水乙醇脱水，最后用二甲苯透明封固。

1.6 Western blot检测黑色素相关蛋白表达

LED蓝光光疗处理细胞后，裂解细胞并提取细胞总蛋白质，总蛋白质(40 μg)在SDS-PAGE凝胶上分离，使用电泳转移系统(Bio-Rad，USA)转移到硝酸纤维素滤膜上(NC)。将膜在常温下用含有5% 奶粉的TBST封闭1.5 h，4 ℃下与抗体一起孵育过夜，二抗在常温下孵育1 h，通过增强化学发光显现，检查特征蛋白表达及其下游信号通路激活情况。

1.7 统计学分析

采用GraphPad Prism统计软件处理所有实验数据。本研究的所有数据采用SPSS进行检验，P<0.05 表明数据间的差异具有统计学意义(数据结果来自3次重复实验)。

2 结 果

2.1 对B16F10细胞活力的影响

通过 MMT 法采用不同强度的LED蓝光光疗照射(1，5，10，20，40，50，60 J/cm2)对B16F10细胞进行处理。由图1可见，与空白对照组相比，LED蓝光光疗照射1，5，10，20，40 J/cm2处理B16F10细胞对细胞的增殖和凋亡无明显影响。以剂量依赖的方式继续进行LED蓝光光疗，照射超过40 J/cm2后，即LED蓝光光疗照射强度为50 J/cm2和60 J/cm2时，可观察到细胞的凋亡的增加、活力显著下降。在此基础上，进一步探究LED蓝光光疗照射(1，5，10，20，40 J/cm2)对细胞生物学功能的影响。

图1 LED蓝光光疗对 B16F10 细胞活力的影响Fig.1 Effects of LED blue on the viability of B16F10 cells

2.2 对B16F10细胞黑色素合成的影响

为研究LED蓝光光疗对B16F10细胞黑色素合成的影响，选取对数生长期的B16F10细胞，进行不同强度的LED蓝光光疗照射给药处理，最后一次照射后于恒温培养箱(37 ℃，5% CO2)中静置培养24 h。NaOH 裂解法测定不同强度的LED蓝光光疗照射(1，5，10，20，40 J/cm2)对B16F10细胞黑色素合成的影响。由图2可见，给药后，相较于空白组，给药组的黑色素含量呈剂量依赖性上升，说明LED蓝光光疗对黑色素合成起促进作用，随着给药强度的增大，促进黑色素生成效果越显著，呈现剂量依赖性。

图2 NaOH裂解法测定不同剂量LED蓝光对黑色素合成的影响Fig.2 Effect of different dosages of LED blue on melanin synthesis by NaOH pyrolysis method

通过Masson-Fontana黑色素胺银染色方法观察不同强度的LED蓝光光疗照射(1，5，10，20，40 J/cm2)B16F10细胞的黑色素合成情况。由图3可见，随着LED蓝光光疗剂量的增加，B16F10细胞中黑色素积累变多，细胞相邻树突间传递的黑色素增加，LED蓝光促进黑色素合成以及传递。

图3 Masson-Fontana 胺银染色法测定不同剂量LED蓝光对黑色素合成的影响Fig.3 Effect of different dosages of LED blue on the synthesis of melanin by Masson-Fontana amine silver staining

2.3 对 B16F10 细胞中黑色素合成相关蛋白 TYR，TRP-1，DCT 表达的影响

采用Western blot研究几种黑色素生成酶在蛋白质水平上的表达。由图4可见，与对照组相比，不同强度的LED蓝光光疗照射(1，5，10，20，40 J/cm2)后，酪氨酸酶(TYR)、相关蛋白(TRP-1)表达显著提高，相关蛋白(DCT)表达没有发生明显变化。关键因子小眼畸形转录因子(Mitf)的表达则发生了显著上调。这些结果表明LED蓝光光疗通过上调酪氨酸酶和Mitf的蛋白水平诱导黑色素合成，并呈剂量依赖性。

图4 不同剂量LED蓝光对酪氨酸酶和Mitf蛋白水平的影响Fig.4 Effects of different dosages of LED blue on tyrosinase and Mitf protein levels

2.4 对 B16F10 细胞中黑色素合成 MAPK 通路相关蛋白表达的影响

为了进一步阐明LED蓝光光疗在黑色素合成中的具体作用机制，以Mitf为最终靶向目标，检测上游信号通路激活情况。选取剂量为40 J/cm2的LED蓝光处理不同时间(0，30，60，120，180，360 min)。由图5可见，MAPK通路被激活。LED蓝光激活p38信号通路，抑制ERK信号通路。研究发现，p38信号通路激活后可促进Mitf的表达，相反ERK信号通路被激活后可促进Mitf的降解。这表明：LED蓝光通过激活p38信号通路，抑制ERK信号通路促进Mitf的表达、抑制降解导致黑色素合成增多。

图5 LED蓝光光疗对 MAPK 通路蛋白活性的影响Fig.5 Effect of LED blue on MAPK pathway protein activity

3 结 论

本研究确定了LED蓝光光疗处理B16F10细胞促进细胞黑色素合成。其特征表现在：与空白对照组相比，不同剂量LED蓝光照射后黑色素合成相关蛋白TYR，TRP-1显著上升，呈现剂量依赖性。小眼畸形转录因子(Mitf)表达明显上升，与之相关的MAPK家族激活，其中p38通路被明显激活、ERK通路降解促进Mitf的表达、抑制降解最终导致黑色素合成增多。

本研究中LED蓝光光疗激活p38信号通路，抑制ERK信号通路。这可能是因为各条MAPK信号通路之间存在内在的负反馈调节。有文献[20]报道，烧伤后大鼠给予微量的H2S使p-ERK 蛋白相对表达量升高，p-JNK和p-p38蛋白相对表达量下降。关于蓝光照射后，p38被激活，ERK被抑制的原因尚需要进一步深入研究。同时在后续的研究中可选取特定抑制剂进一步证实MAPK通路对LED蓝光诱导的黑色素合成的作用。

当前，LED光疗已广泛应用于临床。以LED蓝光为例，可用于治疗白癜风，但机制尚不明确。本实验检测LED蓝光对黑色素合成转运作用的影响及信号通路状态，对蓝光调控黑色素的机制进行深入讨论可进一步推广LED蓝光光疗在临床上的应用。