羊肚菌单孢和多孢菌株大田出菇比较试验

罗友梅 陈瑞雅 张锐杰 李锐新 余佳蝶 贺新生

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

羊肚菌是羊肚菌属Morchella的食药兼用真菌，是我国近十年来发展迅速的食用菌栽培品种之一。其人工栽培技术得到不断的改进和提高，而出菇和农艺性状不稳定则制约着产业的发展[1]。

我国已经发现羊肚菌属有60多个物种[2]，其中大规模商业化栽培的主要为：六妹羊肚菌Morchella sextelata，七妹羊肚菌M. eximia和梯棱羊肚菌M. importuna等[3]。羊肚菌规模化生产的风险极大，大多数共生型的物种人工栽培无法出菇；腐生型的物种若分离方法不当，得到的菌株也不会出菇；大田开放式种植，遇极端高温或风霜雨雪冻等环境条件无法抗御，导致大面积绝收；病虫害日益增多，致使羊肚菌生产每年都有30%～50%的面积减产和绝收，给投资者和生产者造成了极大的经济损失[4,5]。

对羊肚菌单孢菌株及多孢菌株栽培种的制作过程、栽培过程、产量和品质进行比较研究，可以得到高产及品质相对稳定的优良菌株，为羊肚菌种植业的发展提供更多的理论依据和技术支持。

1 试验背景

羊肚菌菌株的分离方法有组织分离法和孢子分离法。业内大多采用组织分离法。但该方法获得的纯种可能出现交配型基因缺失现象[6]，无法完全将子实体内外表面膨大细胞与紧密内组织细胞分开；而膨大细胞萌发的菌丝无繁殖能力，从而导致减产、绝收。对子实体组织分离与孢子分离两种方法获得的羊肚菌菌株进行比较试验的结果：孢子分离的萌发率较组织分离的萌发率高，分别为90%和80%[7]。用孢子分离法，菌丝在母种培养基上生长快，长势强，在综合培养基上生长慢而弱[8]；用组织分离法，无论是采用母种基质还是综合基质，生长速度都较慢，菌丝的颜色、长势等都较孢子分离法差[1,7,9]。

遗传类型属于同宗结合的物种，单孢可以出菇，如次级同宗结合类型的双孢蘑菇Agaricus bisporus。采用单孢出菇的方法筛选出不出菇的单核单孢菌株进行杂交育种，可得到具有明显杂交优势的新菌株。如草菇Volvariella volvacea是初级同宗结合的遗传类型，通过单孢出菇试验可获得出菇性能优良的新菌株[10]。羊肚菌的孢子有30～50个细胞核，属于多核体，是单孢可孕的遗传类型，同一个孢子萌发的菌丝相互接触融合（自融合）是其生长发育成子实体至关重要的步骤。而不同孢子萌发出来的菌丝会发生大量的相互缠绕、自身卷曲、相互打结等现象，无法正常融合甚至发生死亡，导致在栽培过程中出现产量、性状和质量等不稳定问题，采用单孢分离方式可有效避开这一问题[1,11,12]。单孢菌株的形态、质量均较一致，多孢分离物、混合播种的子实体形态变化大、同一栽培基地同样栽培方法的产量差异显著。

单孢可以出菇的物种不是一般意义上的异宗结合类物种，大量研究表明栽培的羊肚菌种类完全可以实现单孢正常出菇，并获得高产[11,12]。本试验采用多孢混种培养，在培养皿内的菌丝生长末端切取单根菌丝转接至新的培养基上，获得纯化的单孢菌丝进而分离单孢的方法来制备栽培用菌株。对广泛栽培的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌进行单、多孢菌株大田出菇对比试验，以验证其出菇的稳定性，筛选产量高的新菌株，为今后羊肚菌栽培新菌株的选育研究提供参考。

2 材料与方法

2.1 供试菌株

梯棱羊肚菌：MT-7；六妹羊肚菌：M-90、M-925、M-1080。原始菌株保存在西南科技大学生命科学与工程学院菌物资源开发利用研究室。

2.2 试验培养基和营养袋制作

（1）平板培养基。配方为蔗糖20 g、玉米粉5 g、蛋白胨1 g、琼脂20 g、水1 000 mL，pH 6.5，各原料混合后加热融化，转移至锥形瓶中与培养皿一起高压蒸汽灭菌，灭菌完成后冷却至45 ℃倒平板，待凝固后倒置备用。

（2）斜面培养基。配方为蔗糖20 g、琼脂20 g， KNO30.5 g、水1 000 mL，pH 6.5。各原料混合后加热融化，分装至小试管中，121 ℃高压灭菌20 min，灭菌完成将试管斜置，待其凝固。

（3）栽培种固体培养基。配方为小麦75 g，木屑23 g，石膏1 g，生石灰1 g。小麦浸泡24 h左右或煮涨至掰开查看无白色物质后，沥干明水，按比例加入干燥木屑、石膏、生石灰拌匀，将水分控制在63%～65%后装袋。采用500～750 mL的菌种袋，每袋装培养料600 g，松紧适度，于121 ℃ 灭菌60 min。

（4）营养袋。制作方法与栽培种培养基一致，将原料按配方混匀后，含水量控制在55%～60%，即可装料。装好的营养袋使用专门的橡皮筋扎口，121 ℃下灭菌60 min，冷却备用。

2.3 制备单孢培养物

按照龚国淑等[13]的单孢分离方法，切取培养皿边缘最稀疏处的单根菌丝，转接到试管中，获得纯化的单孢菌丝，对单孢菌株分别进行编号，培养过程淘汰被污染和菌丝形态异常的试管。共获得54个单孢菌株，其中M-90有14个单孢菌株，M-925有10个，M-1018有13个，MT-7有17个（表1）。

2.4 制备多孢培养物

按郑国扬的方法[14]进行孢子弹射，用接种针蘸取少量的羊肚菌孢子，在平板上连续划线，标记不同的菌株，置于25 ℃培养箱培养并观察生长状态，在培养过程中，对被污染和菌丝形态异常的培养皿予以淘汰，获得多孢菌株15个（表1）。

表1 菌株的编号

2.5 栽培种制备

在灭好菌的菌种袋中接种等量菌丝体，得到单孢和多孢栽培种。20～25 ℃条件下避光培养，每隔24 h用四角法记录菌丝生长长度。

2.6 大田栽培试验

栽培过程分6个步骤：试验用地的前期准备→播种→平棚和小拱棚的搭建→营养袋的摆放→菌丝营养生长阶段的水分和温度管理→出菇阶段管理[1,4,5]。

（1）前期准备。试验栽培用地为一块矩形荒地，在下种前一个月进行机械除草、翻耕（深翻）、曝晒和撒生石灰处理，生石灰用量为25～50 kg/667m2，再次翻耕（浅翻）。在试验用地内建畦，畦面宽1 m，作业走道宽25 cm，畦面上横向每隔0.5 m挖浅沟，使畦面分布面积为0.5 m2的小区，作为菌株的试验小区。

（2）播种。土壤含水量在20%以下，手搓土条不黏手，可以播种。土条黏手、土面或沟内有明水的田块，土壤含水量超过22%，不能下种[16]。用经消毒的铁勺将菌种瓶中的菌种掏出，倒入盆中用手搓散，然后均匀地撒在对应的畦块上，播种量按照0.5 kg/m2进行，播种完成后插标签。每菌株随机播种3个小区，即3个重复。

（3）搭棚。试验田内按3×3（m）的规格打深30 cm的孔洞，插入作为支架的2 m长竹竿，竹竿上部绑小竹竿搭建棚顶，并盖上6针的遮阳网，简易平棚即搭建完成。小拱棚的搭建采用长1.8～2.0 m的竹篾，在田畦上以间距1 m逐根插入土中，再盖上黑膜即可。

（4）生长管理。在播种后4～7天用喷水的方式对全部田畦浇水，使土壤含水量保持在20%左右，检测标准是手搓土基本能成不断裂的条，此时土壤含水量为18～20%。土壤含水量不能超过21%，若土壤手搓黏手，则需通风3～7天。

播种后7～20天，摆放营养袋，用量为8～9个/m2。出菇前20天进行撤袋、催菇操作。在立春后，温度上升至能够稳定在8 ℃以上时，原基开始形成，需要提前浇水使土壤含水量维持在21%～23%，保证有充足的水分供子实体形成和生长。记录出菇时间、出菇密度、出菇时土壤及环境温度、菇形及总重量。幼嫩的子实体为黑灰色，成熟后颜色变淡，当鲜菇的伞盖长度为3～5 cm，不超过7 cm，菌柄长度为3～5 cm，子实体整体长度不超过12 cm时采收。

3 结果与分析

3.1 单孢和多孢菌株在菌种袋中的菌丝生长情况

根据各菌株在菌种袋中的菌丝生长情况绘制生长曲线，结果如表2所示：除A+A菌株因生长缓慢，导致难以记录生长曲线而缺趋势线外，其余各菌株生长的趋势线分别为多项式、对数、线性、乘幂，表明随培养时间延长，氧气的缺少对不同菌株的影响程度不同。

表2 菌株的相关系数和对应的趋势线

菌丝生长在正常条件下初期为线性增长，无色、白色；随着培养时间延长，生长速率减慢，越靠近菌袋底部生长速率越慢；当菌丝长至菌袋底部后，菌丝颜色逐渐加深至浅黄白色、浅黄色；最终菌丝之间相互缠绕长出菌核，使栽培种呈现红褐色。而菌株A、A+D、B+D、D+D所制备的栽培种菌丝生长为线性增长，可看出氧气的减少对这4个菌株的抑制作用小于其他菌株。试验过程中，C菌株的栽培种出现大量被污染的现象，并且未见菌丝颜色进一步转变。

3.2 单孢和多孢菌株出菇密度及形态

（1）单孢菌株。各单孢菌株子实体形态见图1，菌株A、B的菇形偏矮小，菌柄较短，但B菌株子实体较A菌株的细长。C菌株虽有出菇，但子实体出现了大面积染病情况，形态短小，菌盖上下比例不协调，出菇效果不佳。A、B、C菌株出菇密度均低。D菌株子实体呈现淡紫色，中等大小，菌盖与菌柄直径相近，但菌柄偏长，出菇密度为中等，较适宜在生产中应用[1,15]。

图1 不同单孢菌株出菇形态

（2）多孢菌株。从菇体形态看，虽然A9单孢菌株可以正常出菇，但多孢菌株中产量最高的D10+A9菌株（表3），所出的子实体只有D菌株子实体。A6单孢菌株出菇污染较少，而C17+A6菌株污染严重，且出菇大多为A6菌株。由此可见单孢菌株构成多孢菌株后，其自身的出菇能力受到影响。

此外，C17+D7+B8菌株所出的子实体中无C菌株的子实体，而有B、D菌株子实体，可见针对单孢菌株败育影响出菇的情况，采取多孢育种反而具有一定的优势。

3.3 单孢和多孢菌株的产量

试验结果（表3）表明，单孢菌株、多孢同种菌株和多孢不同种菌株之间的产量不同。单孢菌株中A7、A11、C15产量为0，菌株D7、B1、D4、D10产量较高，0.5 m2小区产量分别为400 g、365 g、350 g和310 g。A菌株大部分产量偏低，平均产量仅35.83 g，而D菌株大部分产量偏高，平均产量达116.67 g，C菌株普遍出现污染。因此，总体上以D菌株产量较高、出菇效果良好。

表3 单、多孢菌株小区鲜菇平均产量

多孢菌株中，D10+A9、B5+D5、D4+D2+D3及B10+D6+D12产量较高，0.5 m2小区产量分别为260 g、175 g、125 g和115 g，总体上低于单孢菌株产量；C14+A8、C14+A4、A10+A11产量为0，但构成其的单孢菌株A4、A8、A10，都可正常出菇。D菌株的多孢菌株均呈现减产趋势，表明多孢菌株可能会对高产品种的产量产生负面效应。

4 小结与讨论

试验结果表明，在通气不良的情况下，菌株A、A+D、B+D、D+D在制备的栽培种固体培养基中，菌丝生长前期均为线性增长，较其他菌株受影响小。在出菇效果比较试验中，不同单孢菌株存在较大差异，其中以菌株D（M-1080）表现较好，子实体呈淡紫色，中等大小，菇形较好，出菇密度中等，而菌株A、B、C子实体稀疏，产量低，不宜用于生产。

D菌株单孢菌株、多孢同种和不同种菌株之间的产量差异大，有多孢减产的趋势；另有多孢菌株C14+A4、C14+A8、A10+A11未出菇，但构成其单孢菌株A4、A8、A10都可正常出菇。由此我们推断育种或菌种生产中多孢菌株的出现可能会对产量产生负面的影响。

综上所述，在羊肚菌大规模生产中，要提前选育高产及品质相对稳定的羊肚菌优良菌株。其次，由于不同菌株之间差异显著，播种及菌种生产过程要注意避免不同菌株的人为混合情况，以免得到多孢菌株，对产量造成负面影响。本试验初步得到单孢菌株D7为一优势菌株，但还需要进一步研究和进行生产性试验，以确定单孢分离菌株的出菇性能和产量的稳定性。

此外，在羊肚菌种植过程中还要注意用水时机、用水量、温度和湿度等，在保证菌种优良的条件下，最大限度地出好菇，实现优质、高产。