一株产纤维素酶硫磺菌的生物学特性及其对松针降解效果研究

何建清 张格杰 刘林峰 王思远 马金玉

（1西藏农牧学院理化测试与生物技术中心，西藏林芝 860000；2西藏农牧学院植物科学学院，西藏林芝 860000）

松针是一种可再生的自然资源，分布范围广泛，松针蕴含量在一亿t 以上。松针富含的蛋白质、氨基酸、微量元素和活性物质对作物生长有着重要的作用，松针黄酮还具有独特的水溶性，充分腐熟后会释放进入土壤中，对土壤改良可起到独特的作用[1-2]。同时松针中富含的酸性物质能够降低土壤pH，对碱性土壤起到良好的调节作用，是盐碱地土壤改良的一种有效的生物改良剂[3]。

西藏东南地区松针资源丰富，品种繁多。松针是松树类植物的主要副产物之一，具有再生速度快、四季均可采收、天然蓄积量大的特点。松针堆肥后用于生产土壤改良剂，对合理利用西藏废弃松针资源，改善西藏土壤的生态环境具有积极的作用。

松针富含丰富的木质纤维素，松针中纤维素类物质的质量分数高达56.4%[4]。木质素作为物理屏障，阻碍了纤维素酶与纤维素的作用，故木质纤维素的有效转化需要葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶和木聚糖苷酶等纤维、半纤维素酶及漆酶（Laccase，Lac）、木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）及Mn 依赖过氧化物酶（Mn-dependent peroxidase，MnP）等木质素酶协同作用[5-6]。同时，松针富含油分，能够减少水分的蒸腾以及叶片吸水，阻碍堆肥过程中松针的降解。因此，如何加快松针降解速度是松针堆肥亟待解决的一个重要问题。近年来，生物法预处理由于其环境友好、低能耗、低成本等特点，被认为是最具前景的预处理技术。褐腐菌主要降解针叶树，大量的木质素残留致使腐朽木材呈褐色腐朽[7]。Michael 等[8]首次研究褐腐菌降解针叶树材形成生物燃料过程中的早期降解机制。结果表明，在降解初期褐腐菌通过提高木材生物质的糖化作用，引起木材细胞壁中纤维素成分（包括纤维素和半纤维素）快速、大量地解聚，从而达到生物降解木材的目的[9]。

硫磺菌属Laetiporus隶属于担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、多孔菌目Polyporalaes、拟层孔菌科Fomitopsidaceae。该属真菌广泛分布于世界各地，从寒温带到热带区域都有其分布的报道[10]。硫磺菌是食、药兼用的大型真菌之一[11]。硫磺菌属真菌，易于培养，且富含不饱和脂肪酸、草酸和布里酸等成分，有毒成分极低，甚至无法检测到[12]。该属真菌多生长在针阔叶树的活树、树桩或倒木上，引起树木心材的褐色腐朽[13]。国内外研究表明，褐腐菌因其在环境价值和生物技术方面的潜能而被备受关注。目前，国内对硫磺菌属真菌分类[10]、驯化[13]及生物学特性[14]等方面已有不少研究，但其产木质纤维素酶的方面研究还很少[15]，利用其进行松针的降解还未见报道。为此，笔者研究利用前期筛选的1 株产纤维素酶活性较强的硫磺菌[16]，对其进行鉴定，并研究其菌丝生长最适碳源、碳源、温度及pH，以及对松针的降解能力，以期为该菌的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）供试菌株：供试菌株子实体采自西藏色季拉山海拔3600 m 左右的松树活立木上，采用组织分离法获得硫磺菌菌株，编号为LS，保藏于西藏农牧学院真菌实验室。（2）松针材料：2020年10—12月于西藏农牧学院校园捡拾地面当季凋落的原状松针带回实验室，剔除树枝、树皮、灌木叶片等杂物，保留外形完整未分解状态的松针。用自来水快速冲洗松针，沥水后置于60 ℃烘箱内烘48 h，粉碎，过40 目筛，备用。（3）培养基：PDA 培养基用于菌种分离与保藏、形态特征观察、菌种培养；基础培养基用于菌丝体生物学特性试验，配方见参考文献[6]。松针固体发酵培养基：松针粉20.0 g，60 mL PD 培养液。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离、培养与保存

组织分离法分离菌株[17]。菌株编号为LS，于25 ℃避光培养7d，于4 ℃保藏。

1.2.2 形态与分子鉴定

观察子实体形态并记录。菌丝显微观察采用插片培养法。分子鉴定采用内转录间隔区（ITS）鉴定法。结合形态特征和分子生物学特性确定目标菌株的分类学地位。

为了验证本工作提出的改进的MPDTC方法的正确性,利用Matlab/Simulink建立驱动系统的仿真模型进行仿真研究.仿真中MPDTC的磁链和转矩权重因子为kψ=2,kT=1,LSFMPDTC的权重因子为kψ=2,kT=1,kf=0.1,电机的额定值和相关参数如表1所示,系统采样频率为6 kHz,Udc为540 V.

1.2.3 碳氮源试验

参考文献[6]的方法，采用固体平板培养法，分别测定蔗糖、阿拉伯糖、可溶性淀粉、木糖、甘露醇对菌株LS菌丝生长的影响；氮源酵母浸膏、硫酸铵、牛肉膏、硝酸钾、赖氨酸和谷氨酸对菌株LS 菌丝生长的影响。每处理重复3次。

1.2.4 pH对菌丝生长的影响

将固定碳氮源的培养基的pH调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 共7 个梯度。将其置于28 ℃培养箱中，接种、培养，测定方法同上。每处理重复3次。

1.2.5 温度对菌丝生长的影响

将菌株LS接种到相同的培养基中，分别放置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的恒温培养箱中。测定方法同上。每处理重复3次。

1.2.6 松针固体发酵试验

准确称取松针粉20 g 于250 mL 广口瓶中，加入60 mL PD 培养液，混合均匀，121 ℃灭菌30 min。接种直径5 mm 的在PDA 培养基上扩繁7 d 的菌饼6块，25 ℃恒温培养箱中培养30 d，以不接菌的样品为对照，试验重复3次。按参考文献[18]测定发酵前后松针中纤维素、半纤维素和木质素含量。

1.2.7 数据统计分析

所有试验数据使用Microsoft Excel 2007 进行初步处理后，采用DPS 7.05数据处理系统统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株LS鉴定结果

2.1.1 形态特征

菌株LS 担子果一年生，无柄或有近似侧生柄，覆瓦状结构（图1a）。担子果幼嫩时肉质，烘干后较轻，易碎；菌盖平展，扇形至半圆形；幼嫩时上层表面亮鲑红橙色，风干后变为浅棕色，光滑无毛，有明显的环纹或微弱环纹；边缘幼嫩时奶油色至浅黄色，老后变为橙黄色至红褐色，钝圆，较厚；菌孔表面新鲜时柠檬黄色至亮奶油黄色，干后变为浅黄色，不育边较窄，宽1 mm；菌孔初时近圆形，生长后变得不规则，菌孔2～4 mm，孔壁较薄，全缘到撕裂；菌肉新鲜时白色，厚3 cm，基部略厚并下延至菌柄附着处，干后奶油色至淡黄色；菌管颜色与孔面颜色相同，易碎，长为1～5 mm。无气味，无口感。孢子卵圆形至椭圆形，透明，光滑，（5.5～7.2）μm×（3.5～4.5）μm。菌株LS 在PDA 培养基中菌落表现为平展，白色或淡黄白色，气生菌丝发达，绒毛状，细密，整齐，生长较快（图1 b）。

图1 硫磺菌菌株LS的形态特征

2.1.2 ITS序列分析

经PCR 扩增、与载体连接及测序，得到菌株LS的ITS序列。通过NCBI网站进行在线Blast比对，下载髙山硫磺菌、硫色硫磺菌、哀牢山硫磺菌、针叶树硫磺菌、变孢硫磺菌、环纹硫磺菌及辛辛那提硫磺菌等相关硫磺菌属已发表菌株的ITS 序列，利用MEGA5.0 进行系统发育分析，发现该序列与环纹硫磺菌和硫色硫磺菌相似度均达99.81%。菌株LS 与硫色硫磺菌聚在一起，且支持率为93%（图2）。结合该菌株形态特征[19]，将其鉴定为硫色硫磺菌Laeti-porus sulphureus。

图2 基于rDNA-ITS基因片段的系统发育图

2.2 碳源对硫磺菌LS菌丝生长的影响

由表2 可知，供试6 种碳源中，以葡萄糖为碳源时，硫磺菌LS菌丝生长最快，其菌丝淡黄浓密，菌落边缘规则，且日均长速显著快于其他碳源，为5.10 mm/d，蔗糖、阿拉伯糖次之；木糖和甘露醇的菌丝日均长速和长势一般，可溶性淀粉菌丝日均长速最慢，仅为2.85 mm/d。综合菌丝日均长速和长势，硫磺菌LS菌株固体培养基中的最佳碳源为葡萄糖。

表2 供试碳源对硫磺菌LS菌丝生长的影响

2.3 氮源对硫磺菌LS菌丝生长的影响

由表3 可知，以牛肉膏为氮源时硫磺菌LS 菌丝平均长速最快，为5.60 mm/d，且菌丝粗壮浓密，边缘规则。蛋白胨、酵母粉和谷氨酸为氮源时，硫磺菌LS 菌丝生长速度无显著差异；硫磺菌LS 不能利用硫酸铵、硝酸钾和赖氨酸。因此，综合菌丝长势和菌丝平均长速，确定硫磺菌LS菌丝生长的最适氮源为牛肉膏。

表3 供试氮源对硫磺菌LS菌丝生长的影响

2.4 培养温度对硫磺菌LS菌丝生长的影响

由图3 可知，硫磺菌LS 菌丝生长速度随温度的升高（15～25 ℃）而加快，在30 ℃时，菌丝日均长速显著变慢（P＜0.05），仅为1.05 mm/d；25 ℃时，菌丝日均长速最快，为4.45 mm/d，且菌丝浓密；35 ℃时，菌丝不能生长。综合考虑菌丝日均长速和长势，硫磺菌LS菌丝的最适生长温度为25 ℃，其次为20 ℃。

图3 培养温度对硫黄菌LS菌丝生长的影响

2.5 pH对硫磺菌LS菌丝生长的影响

由图4 可知，随着培养基的pH 上升，硫磺菌LS菌丝日均长速逐渐变慢。pH 为4.0，其菌丝生长速度最快，为6.25 mm/d，其次pH 为5.0，为4.60 mm/d；第三是pH 为6.0，为1.15 mm/d；pH 为7、8、9 和pH 为10，硫磺菌LS菌丝基本不生长。综合菌丝日均长速及长势，硫磺菌LS培养基的最适pH为4.0。

图4 pH对硫磺菌LS菌丝生长的影响

2.6 发酵后松针木质纤维素的含量

为研究硫磺菌菌株LS对松针木质纤维素的降解效果，测定发酵前后松针的纤维素、半纤维素及木质素的含量（图5）。发酵前松针中纤维素质量分数为50.08%，半纤维素质量分数为13.55%，木质素质量分数为40.71%。经硫磺菌菌株LS 发酵30 d 后，三者含量均有一定程度下降，纤维素、半纤维素和木质素质量分数分别降至24.10%、11.35% 和37.14%，降解率分别为51.88%、16.24% 和8.77%。以上结果表明，硫磺菌菌株LS 可产生降解木质纤维素的主要相关酶系，且对于木质纤维素的降解效果明显。

图5 发酵前后松针中木质纤维素的质量分数

3 小结与讨论

从形态学和分子生物学特征初步确定菌株LS为硫色硫磺菌Laetiporus sulphureus。培养试验表明，该菌株菌丝生长最适碳源为葡萄糖，氮源为牛肉膏，最适培养温度为25 ℃，pH 为4。降解松针木质纤维素试验结果表明，菌株LS 对松针发酵30 d后，松针中的纤维素、半纤维素、木质素降解率分别为51.88%、16.24%、8.77%。

松针因其独特的生存环境和生理功能，造就独特的内含物质，显著不同于一般禾本科作物，是一种独特的有机肥原材料[3]。纤维素是松针细胞重要组成成分之一。纤维素属于大分子聚合物，是分布最广的碳水化合物[4]。由于纤维素具有水不溶性的高结晶结构，外围被木质素包围，难以大量降解。褐腐菌多为担子菌类，分泌纤维素酶系，可分解纤维素和半纤维素。但它对木质素的降解能力很弱。硫色硫磺菌能较强地降解松针纤维素和半纤维素，但对木质素的降解率较低。白腐真菌是一类能够降解木材并造成白色腐朽的真菌，它们能够分泌多种降解木质纤维素的胞外酶，且降解木质素能力强于降解纤维素[20]。用褐腐菌和白腐菌的混合菌群，可以起到更加显著的效果，缩短预处理周期[21]。今后应以混合型菌剂降解松针为研究方向，以及各种菌株之间降解过程中的协助与拮抗作用，以寻找最佳的混合菌种，以实现松针的高效降解，提高松针堆肥的利用价值。