左西孟旦对大鼠急性心肌梗死后心肌纤维化及心功能的影响

刘亚丽，李春彦，李雅丽，寇惠芬，许晓伟，李新军*

河北北方学院附属第二医院 1.心内科，2.综合病区，河北 张家口 075100

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是影响我国数百万人生命健康的主要心血管疾病。其较为重要的病理特征为心肌纤维化，可表现为心肌梗死区细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积，进而导致心肌组织硬化，限制心正常的活动[1]。虽然最初形成的纤维化组织对防止梗死心破裂具有保护作用，但持续的心肌纤维化会导致心功能下降[2]。据文献报道：心肌纤维化与肌成纤维细胞TGF-β途径结合TGF-β受体有关[3]。为防止心肌纤维化的进展，抑制TGF-β途径介导的肌成纤维细胞形成至关重要。左西孟旦是一种通过稳定肌钙蛋白C而不增加心肌细胞内钙浓度来增强心肌收缩的正性肌力药物，广泛用于治疗心力衰竭和低输出量综合征[4]。此外，它通过开放ATP敏感钾通道和增加内皮型一氧化氮合酶（eNOS）依赖性NO释放具有舒张血管的作用[5]。值得注意的是，最近临床研究发现，左西孟旦能延缓慢性心力衰竭患者心肌纤维化进展[6]。相关基础研究发现，左西孟旦具有抗炎和抗凋亡的特性，如左西孟旦可降低LPS诱导的巨噬细胞和成纤维细胞IL-6上调，保护H9C2心肌细胞免受同型半胱氨酸诱导的氧化应激和凋亡[7]。然而，目前还没有关于左西孟旦抗心肌纤维化作用的研究。本研究探讨左西孟旦对MI大鼠心肌纤维化和TGF-β1刺激的原代大鼠心肌成纤维细胞的影响，并对其作用机制进行分析，为左西孟旦治疗心肌纤维化的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

90只雄性SD大鼠购自上海凯学生物科技有限公司，合格证编号：SCXK 2008-0016。大鼠均为8周龄，体重200～240 g，不含特定病原体（SPF）。将大鼠在无病原体的条件下以12 h的明/暗周期饲养，温度为（23±1）℃，湿度为（55±5）%，自由获得食物和水。

1.2 研究方法

1.2.1 建立MI模型 参照文献[8]，大鼠腹膜内注射10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉，并使用小型动物呼吸机（美国Harvard 683公司）进行通气气管插管。然后，对大鼠进行开胸手术，用5-0聚丙烯缝合线结扎大鼠左冠状动脉前降支。缝合切口，将动物放回笼中。术后通过经胸超声心动图评估心功能。根据超声心动图结果，将30只存活的MI大鼠随机分为：模型组和左西孟旦组（Levo组），每组15只。假手术组（n=10）的大鼠同样开胸但不进行动脉结扎。给予大鼠的左西孟旦剂量为4.67μg·kg-1·d-1（该剂量相当于临床上治疗MI患者的剂量），将药物溶解于蒸馏水中，灌胃给药28 d。假手术组和模型组大鼠同时给等量蒸馏水。治疗28 d后，各组存活情况：假手术组10只，模型组10只，Levo组14只。

1.2.2 超声心动图评价左室功能 治疗28 d后，用Vevo 2100超声（加拿大visualonics公司）及相应探头（MS-250）进行超声心动图检查，中心频率21 MHz。获取左室胸骨旁短轴二维M型图像，通过图像测量相关数值，每个测量点记录3个心动周期。测量并收集射血分数（ejection fraction，EF）、左室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension，LVEDs）、缩短分数（fractional shortening，FS）和左室舒张末期内径（left ventricular end diastolic dimension，LVEDd）。

1.2.3 组织病理学检查 将心水平切割成两部分。取上1/3部分，用4%多聚甲醛（pH 7.4）固定。用苏木精-伊红（HE）和马森三色（Masson-trichrome）对大鼠心肌组织进行染色。显微镜下观察病理切片。应用Image Pro-Plus软件分析梗死边缘区胶原体积分数（CVF）。选择8个Masson染色切片的单独视图（放大倍数＝原始图像×400），采用以下公式计算，CVF＝胶原面积/总视觉面积×100%，评估心肌纤维化程度。

1.2.4 心肌成纤维细胞的分离和治疗 用混合酶消化液（0.06%胰蛋白酶和0.04%Ⅱ型胶原酶溶于不含钙和镁的D-PBS）分离新生SD大鼠心肌成纤维细胞。利用心肌组织中不同细胞的黏附特性差异，将成纤维细胞从心肌细胞中分离。第2～6代细胞用无血清培养基培养24 h，然后用20 ng/ml TGF-β1（美国PeproTech公司），20 ng/ml TGF-β1+100μmol/L Levo或20 ng/ml TGF-β1+100μmol/L Levo+1 μmol/L SIRT1特异性抑制剂Sirtinol（美国Selleck公司）处理细胞，持续24 h。收集细胞和上清液进行进一步实验。

1.2.5 酶联免疫吸附法测定上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量 使用酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（美国ImmunoWay Biotechnology公司）测量细胞上清液中的Ⅰ型和Ⅲ型胶原。每组的细胞上清液用稀释剂稀释。经过一系列步骤后，在450 nm处进行分光光度检测。绘制曲线并计算样品浓度。

1.2.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）测定mRNA表达 用TRIzol试剂（美国Thermo Scientific公司）按照说明书步骤，提取总RNA。然后，使用cDNA合成试剂盒（上海威奥生物科技有限公司），根据步骤合成cDNA。用以下热循环模式进行qPCR：50℃保持2 min，95℃保持2 min，然后进行40个循环的扩增（95℃保持15 min，60℃保持1 min和72℃保持30 min）。反应体系为20μl，包括7μl焦碳酸二乙酯水（研科生物，中国）、10μl SYBRGreen Master（赛默飞，美国）、正向和反向引物各1μl以及1μl cDNA。在每个循环结束时检测管中SYBR Green荧光的吸收值，并获取相应的Ct值。管家基因GAPDH用作内部对照。目标基因包括COL1A1和COL3A1。引物由美国Invitrogen公司提供。使用2-ΔΔCt方法计算靶基因的相对表达值。引物序列：COL3A1：正向5'-ATATCAAACACGCAAGGCCA-3'和 反 向 5'-TTGCTGGGGTTTCAGAGAGTT-3'，COL1A1：正向5'-CAGAGCACCATTTTCCAAAGCA-3'和 反 向 5'-GGTACAGAGTCTCTTGCTTCCT-3’，GAPDH：正向5'-ATTCCATCCCAGACCCCATAAC-3'和 反 向 5'-GCAGCGAACTTTATTGATGGTAT-3'。

1.2.7 Western blot测定蛋白表达 研磨大鼠心，并用冷却的RIPA裂解缓冲液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）置于冰上匀浆，提取总蛋白。使用BCA试剂盒（上海通蔚有限公司），按照使用说明书测量每个样品中的蛋白质浓度。通过电泳将分离的蛋白质转移到硝化纤维膜上，用5%脱脂牛奶封闭膜2 h。然后在4℃下与所需的一抗孵育12 h，再与HRP山羊抗兔IgG二抗（1：10000，北京冠星宇科技有限公司）在37℃下孵育1 h，最后用ECL检测试剂在室温下处理1 min（美国GEHealthcare公司）。使用Bio-Rad Image Lab软件对蛋白质条带进行可视化和分析。最终报告SIRT1、TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的数据是通过GADPH归一化的条带密度，而p-Smad3用Smad3标准化。SIRT1一抗、TGF-β1一抗、α-SMA一抗、p-Smad3一抗及Smad3一抗购自美国Abcam公司；GAPDH抗体、CollagenⅠ抗体和CollagenⅢ抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.3 数据分析

使用SPSS 22.0进行统计分析。结果表示为平均值±SEM，所有结果的统计显著性使用方差检验或非参数检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 左西孟旦对MI大鼠心功能的影响

超声心动图测量大鼠的心功能发现，与假手术组相比，模型组大鼠的LVEDs和LVEDd显著增加（P＜0.01），而EF和左心室FS显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，Levo组大鼠的LVEDs降低（P＜0.05），而EF和FS显著升高（P＜0.01）。详见表1。这些结果表明，左西孟旦可以改善MI大鼠的心功能。

表1 超声心动图评估大鼠心功能Tab.1 Echocardiographic evaluation of cardiac function in rats

2.2 左西孟旦对MI大鼠梗死边缘区胶原沉积的影响

HE染色显示，假手术组大鼠的心肌组织结构正常，而模型组可观察到广泛的坏死心肌组织，并伴有炎性细胞浸润。左西孟旦治疗可显著减少坏死心肌组织并抑制炎性细胞的浸润（图1A）。Masson染色显示，模型大鼠梗死边界区域存在大量胶原蛋白沉积，而左西孟旦处理可显著减少胶原蛋白沉积的含量。进一步定量胶原蛋白的体积分数（CVF）。与假手术组相比，模型组CVF增加了408.2%（P＜0.001）。用左西孟旦治疗后，CVF降低了52.63%（P＜0.01，图1B）。通过RT-qPCR进一步评估心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量，与假手术组相比，模型组胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的mRNA表达显著提高（P＜0.001），而左西孟旦治疗显著降低了心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量（P＜0.01），见图1C，D。这些结果表明，左西孟旦可以通过抑制胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的表达和沉积来有效减轻心肌纤维化。

图1 左西孟旦对MI大鼠梗死边缘区胶原沉积的影响A：HE和Masson-trichrome染色心肌组织的代表性图像（比例尺50μm，放大200倍，箭头分别标注炎性细胞和胶原纤维）B：分析CVF以定量评估心肌组织中的胶原蛋白含量C，D：RT-qPCR分析心肌组织中Ⅰ和Ⅲ型胶原的RNA表达*P＜0.05，***P＜0.001，与假手术组相比##P＜0.01，与模型组相比Fig.1 Effect of levosimendan on collagen deposition in theinfarct margin of MIratsA:HE and Masson's representative images of heart tissue stained(Scale:50μm,×200,arrows indicated inflammatory cells and collagen fibers,respectively)；B:CVF was analyzed to quantitatively evaluate the collagen content in heart tissue；C,D:RT-qPCR was used to analyze the RNA expression of typeⅠand typeⅢcollagen in heart tissueCompared with sham group,*P＜0.05,***P＜0.001;compared with model group,##P＜0.01

2.3 左西孟旦对MI大鼠心肌组织中SIRT1/TGF-β1/Smad3信号通路影响

SIRT1/TGF-β1/Smads信号通路与心肌纤维化密切相关。本研究测量SIRT1、TGF-β1和Smad3在小鼠心肌中的表达，如图2所示，与假手术组相比，模型组SIRT1蛋白表达下调67%（P＜0.001），TGF-β1和p-Smad3蛋白表达上调851%和397%（P＜0.001）。而左西孟旦治疗显著上调MI大鼠心肌组织中SIRT1蛋白表达（增加168%），下调TGF-β1（降低60%）和p-Smad3（降低47%）蛋白表达，均为P＜0.01。

图2 左西孟旦对MI大鼠心肌组织中SIRT1/TGF-β1/Smad3信号通路的影响A：Western blot分析心肌组织SIRT1、TGF-β1、p-Smad3和Smad3蛋白表达 B～D：SIRT1、TGF-β1、p-Smad3和Smad3蛋白表达的定量分析***P＜0.001，与假手术组相比##P＜0.01，与模型组相比Fig.2 Effect of levosimendan on SIRT1/TGF-β1/Smad3 signaling pathway in theheart of MIratsA:Western blot analysis of SIRT1,TGF-β1,p-Smad3 and Smad3 protein expression in heart tissue;B-D:Quantitative analysis of SIRT1,TGF-β 1,p-Smad3 and Smad3 protein expression；Compared with sham group,***P＜0.001;compared with model group,##P＜0.01

2.4 左西孟旦对TGF-β1刺激心肌成纤维细胞的影响

研究进一步分析左西孟旦和SIRT1特异性抑制剂Sirtinol对TGF-β1刺激的心肌成纤维细胞的影响。采用ELISA检测试剂盒检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量，结果见表2所示，TGF-β1处理的细胞型胶原含量明显高于对照DMEM培养基处理的细胞（P＜0.001）。左西孟旦处理显著降低了TGF-β1诱导的胶原水平（P＜0.01），而Sirtinol的加入明显降低了左西孟旦的抑制能力（P＜0.01）。

表2 左西孟旦对TGF-β1刺激的心肌成纤维细胞胶原蛋白产生的影响Tab.2 Effect of levosimendan on collagen production in TGF-β1 stimulated cardiac fibroblasts

TGF-β1诱导上皮细胞转化为成纤维细胞，成纤维细胞是胶原的主要生产者，其特征在于存在α-SMA[9]。肌成纤维细胞是成纤维细胞的活化形式。通过Western blot分析心肌成纤维细胞SIRT1/TGF-β1/Smad3信号通路和胶原蛋白表达，结果见图3和表3所示，在TGF-β1刺激的细胞中，α-SMA、p-Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达上调（P＜0.001），表明成纤维细胞在表型上转化为成肌纤维细胞，并合成胶原。左西孟旦处理抑制了TGF-β1诱导的α-SMA、p-Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达（P＜0.01），而Sirtinol的加入明显降低了左西孟旦的抑制能力（P＜0.01）。这些数据表明，SIRT1/TGF-β1/Smad3信号通路在心肌成纤维细胞胶原合成中起重要作用，左西孟旦可能通过该信号通路抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞的转化，从而有效抑制心肌成纤维细胞的胶原合成，降低心肌纤维化。

表3 左西孟旦对TGF-β1刺激的心肌成纤维细胞SIRT1/TGF-β1/Smad3信号通路和胶原蛋白的影响Tab.3 Effects of levosimendan on SIRT1/TGF-β1/Smad3 signaling pathway and collagen in TGF-β1 stimulated cardiac fibroblasts

图3 Western blot分析心肌成纤维细胞SIRT1/TGF-β1/Smad3信号通路和胶原蛋白表达Fig.3 Western blot analysis of SIRT1/TGF-β1/Smad3 signaling pathway and collagen expression in cardiac fibroblasts

3 讨论

心肌纤维化是一种与几乎所有形式的心肌病相关的病理变化。心肌细胞的这种病理重塑涉及肌成纤维细胞产生的ECM蛋白的过度沉积，有助于降低组织顺应性并加速向心衰的进展[3]。肌成纤维细胞的起源目前尚未达成一致意见，通常心肌损伤后可促进肌成纤维细胞转分化，而心肌成纤维细胞的激活即可导致心肌纤维化[10]。因此，靶向心肌成纤维细胞和ECM的沉积将是心血管疾病的一种有吸引力的治疗方法。左西孟旦因为其具有保护心肌等重要功能，已广泛应用于临床治疗缺血性心肌病[6]。本研究发现大鼠LAD结扎术后心功能严重受损，梗死区边缘区紊乱的心肌细胞中广泛沉积Ⅰ型和Ⅲ型胶原。左西孟旦治疗28 d后发现，大鼠心功能明显改善且胶原沉积明显减少，提示左西孟旦可改善心肌纤维化。先前的研究表明，左西孟旦可以通过抑制花生酸代谢、抑制氧化应激和减缓心力衰竭的进展来改善心功能和保护H9C2细胞[7]。本研究进一步探讨了左西孟旦抗纤维化作用的分子机制。

SIRT1是一种关键的调节因子，与多种疾病相关，这是因为其参与了细胞中的多种活动如：细胞存活、凋亡、基因沉默和表达、细胞代谢、细胞衰老等[11]。先前的研究表明，活化的SIRT1可以保护心肌免受血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚和功能障碍的影响，且上调心肌细胞中SIRT1，可减少细胞氧化应激损伤，进而抑制细胞凋亡和衰老[12,13]。本研究发现，MI大鼠心肌组织中以及TGF-β1刺激的心肌成纤维细胞中SIRT1的表达降低。然而，在体内和体外给药左西孟旦显著增加了SIRT1蛋白的表达。值得注意的是，在体外试验中，SIRT1特异性抑制剂Sirtinol逆转了左西孟旦改善TGF-β1诱导的胶原水平和相关胶原蛋白合成的作用。这些数据表明，SIRT1参与左西孟旦对TGF-β1诱导的心肌纤维化的保护作用。

SIRT1活性的增加可能影响一系列下游靶点，包括TGF-β1，一种多效性细胞因子（促纤维化和炎症因子），参与免疫应答和纤维化的发展[11]。TGF-β1信号途径与成纤维细胞活化以及ECM生成密切相关[14]。通过TGF-β1与质膜受体相结合，继而诱导Smad3转录因子磷酸化，然后磷酸化的Smad3转移到细胞核内，进一步增加纤维化相关基因的转录，包括Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原[15]。TGF-β/Smad3已成为改善心肌纤维化的潜在治疗靶点。本研究发现MI大鼠心肌梗死区边缘区有大量的Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积，TGF-β1和Smad3表达明显上调，提示TGF-β1/Smad3通路在MI大鼠心肌纤维化的过程中起到一定的作用。左西孟旦可改善心功能，抑制TGF-β1和Smad3的表达。Smad3与心肌梗死密切相关，在心肌纤维化重塑的发病机制中发挥重要作用[14]。它还能促进肌成纤维细胞增殖、分化、迁移等方式来调控ECM蛋白的合成[15]。体外研究表明，左西孟旦可抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞Smad3磷酸化，还能抑制心肌成纤维细胞转化，肌成纤维细胞是胶原的主要生成者。结果表明，左西孟旦可部分通过SIRT1/TGF-β1/Smad3信号通路减轻心肌纤维化。

总之，本研究组体内和体外研究表明，左西孟旦具有抗纤维化和心肌保护作用。这些作用可能通过SIRT1/TGF-β1/Smad3信号通路介导。SIRT1和TGF-β 1是目前治疗心肌纤维化有吸引力的靶点，本研究为左西孟旦在纤维化疾病中的临床应用提供了新的思路。