针康法对脑缺血大鼠缺血区BDNF、GFAP 和Caspase-3基因表达的影响

孔 妍，关睿骞，刘双岭

（黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150010）

脑缺血性脑血管病属于中医学的“中风”范畴，致残性较高、治疗周期偏长、预后多不良，约占脑血管病的70%以上，是临床常见病、多发病，多见于老年人。在世界范围内，脑缺血性脑血管病是导致残疾、死亡等常见疾病，其高发病率已成为威胁整个人类健康的罪魁祸首[1-4]。流行病学研究表明，每年约有1 500 万人遭受脑缺血性脑血管病的困扰，其中三分之一的患者丧生，另外三分之一的患者饱受身体残疾和功能障碍的影响，给家庭和社会带来巨大负担[1]。寻找防治该病的方法对于改善患者生活质量、恢复运动功能、改善疾病不良预后具有重要意义。针康法是针灸疗法和康复疗法的有机结合。导师唐强教授基于头穴丛刺治疗脑血管疾病的明显疗效与脑可塑性理论，将传统医学中头穴丛刺法与现代医学中康复技术（Bobath 疗法、PNF 法、运动再学习等）有机结合治疗脑卒中后感觉、运动等功能障碍，获得了满意疗效[5-8]。本研究旨在探究针康法对脑缺血大鼠缺血区BDNF、GFAP 和Caspase-3 基因表达的影响，以明确针康法治疗脑血管疾病的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性SD 大鼠50 只，清洁级，体质量220～240 g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。标准颗粒饲料喂养，周期照明，室内室温20～25℃，相对湿度 40%～70%，实验期间动物自由饮食和饮水。大鼠适应性喂养7 d 后，随机分为空白组、模型组、针灸组、康复组和针康组，每组10 只。

1.1.2 仪器 多功能酶标仪（杭州奥盛仪器有限公司，型号：AMR-100）；试验用电子秤（北京冀诺泰科技发展有限公司，型号：JNT-DC）；高精度凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；IBAS 2.5 全自动图像分析系统（德国WKontron 公司）；6010 可见-紫外分光光度计（美国安捷伦上海分析仪器厂）；无菌EP 管（美国 Axygen 公司）；微量掌式离心机（德国WSIGMA 公司）；高速冷冻离心机（美国Beehman 公司）；-20℃冰箱（中国青岛海尔电器有限公司）；超低温-80℃冰箱（日本SANYO 公司）；电热恒温水浴锅（中国上海比朗国际有限公司）；高压灭菌器（德国BMT 有限公司）；高效微波炉（中国格兰仕有限公司）；恒温电热恒温干燥箱（德国梅尔特公司）；高效制冰机（美国Grant 公司）；大鼠专业跑台（上海立泰生物科技有限公司）；Real-time PCR 系统（美国Applied Bio-Systems Instruments 公 司，型 号：ABI 7500）。

1.1.3 试剂 1% PMSF（苯基甲烷磺酰氟）（Beyotime公司，批号：ST505）；兔抗大鼠BDNF 单克隆抗体（武汉博士德公司，货号：WH-4234）；兔抗大鼠Caspsae3 单克隆抗体(武汉博士德公司，货号：WH-3234）；兔抗大鼠GFAP 多克隆抗体（武汉博士德公司，货号：WH-3454）；山羊抗兔IgG 抗体（Bioker 公司，货号：DD1500）；10%水合氯醛（北京六一试剂厂）；中性福尔马林固定液（索莱宝科技有限公司，货号：G2161）；RIPA组织裂解液（南京碧云天生物制剂公司，批号125-34）；TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司，批号：15596018）；逆转录试剂盒（美国Promega 公司，批号：A5000）；实时定量PCR 反应体系试剂盒（美国Promega 公司，批号：A6010）。

1.2 动物造模 本研究大鼠脑缺血模型参照Longa 改良线栓法，具体操作步骤如下：尼龙线栓子的制备，实验用尼龙线直径为0.20 mm，每段长500 mm，在解剖显微镜下将尼龙线顶端烧成直径为0.25～0.30 mm的光滑圆球，在距头端18.00 mm和22.00 mm处做标记，酒精清洁后置1:2 500 u 肝素生理盐水中备用。模型制备方法：10%水合氯酵（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，将大鼠固定在实验台上，仰卧位取颈正中切口，切开皮肤，钝性分离各层组织，分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA），向上分离右颈外动脉（external carotid artery，ECA）、颈内动脉（ICA），在近 CCA分叉处约 6 mm 处结扎ECA，于CCA 近心端夹上动脉夹，在ECA 近分叉处留置一打好结的丝线，勿收紧线结，在ECA 结扎处与分叉处之间做一直径约0.20 mm的V 型切口，将尼龙线结扎切口处轻轻插入，轻轻收紧线结，松动脉夹，将尼龙线顺MCA经ICA送入颜内，插入深度约19 mm，微遇阻力时停止，使尼龙线头端位于MCA 起始处，附断MCA 的血流。收紧丝线，海绵胶止血，缝合伤口，单笼饲养。空白组只进行麻醉和血管分离术，不结扎血管及导入线栓。

1.3 干预方法 空白组：假手术后不予任何处置，放回笼中安静饲养。模型组：术后不予任何处置，放回笼中安静饲养。针刺组：造模后24 h 给予头穴从刺法，在相应的刺激区，用华佗牌针灸针（0.25 mm×25 mm）在取百会及百会左、右侧各旁开4 mm 处向前平刺至顶前区，深度0.5 寸，其针刺区域覆盖大鼠顶区和顶前区，针后捻转1 min，频率每分钟200 转，留针6 h，每2 h 捻转1 次，每次15 min，每日1 次，共14 d。康复组：造模后24 h 给予跑台训练，每日25 min，每日1 次。跑台参数设置如下，平板斜度设为零，履带速度：术后第1～3 天为5 m/min；术后第4～14 天，10 m/min；第14 天及以后，15 m/min；每日1 次，共14 d。针康组：造模后24 h 给予针刺结合运动跑台训练。针刺操作方法同针灸组，康复操作方法同康复组，共14 d。

1.4 样本采集 10%水合氯酸腹腔注射麻醉生效后仰卧固定，迅速打开胸腔，暴露心脏，将输液器针头从心尖部刺入左心室，剪右心耳，0.9%生理盐水灌流，观察大鼠的眼球和肺逐渐变白后，迅速完整地取出的脑组织作冠状切面，自切面向头侧3 mm 左右作另一切面，取出的脑组织-80℃低温冷藏备用，避免反复冻融。

1.5 检测指标与检测方法

1.5.1 qRT-PCR 检测BDNF、GFAP 和Caspase-3 mRNA表达情况 取适量病变区脑组织，TRIzol 试剂提取脑组织样品总RNA，6010 可见-紫外分光光度计检测RNA 含量及质量，使用高效cDNA 逆转录试剂盒制备cDNA。冰上配制实时定量PCR 反应体系，qRT-PCR 在ABI 7500 实 时PCR 系 统 上 进 行。在前期研究基础上，检测如下指标：BDNF 上游GATCCACTGAGCAAAGCCGA，下游CTCACCTGGT GGAACATTGTG；GFAP 上游CCAAGCGGAGACAGA TCAAC，下游CCCAGGTCATTGGGGATCTT；Caspase-3 上游CGGCATGGGAGACAGATCAAC，下游CAACCAGGTCATGTGGATCTT；β-Actin F 上游ACGG TCAGGTCATCACTATC，下游TGCCACAGGATTCC ATACC。并使用2−ΔΔCt方法计算mRNA表达的相对定量。

1.5.2 Western blot 检 测BDNF、GFAP 和Caspase-3 蛋白表达情况 从-80℃低温冷藏冰箱取出脑组织，用1 mL 冰冷RIPA 组织裂解液，添加1% PMSF（苯基甲烷磺酰氟）、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂制备脑总蛋白。液氮研磨，4 ℃，12 000 rpm 离心30 min，获得蛋白上清。用BCA 法测定蛋白浓度。20 μg 蛋白在10% SDS-PAGE 凝胶上电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在TBS-Tween 20 中用5%脱脂牛奶封闭后，4℃一抗下孵膜，如下：兔抗大鼠BDNF 单克隆抗体（1:1 000），兔抗大鼠Caspsae3 单克隆抗体（1:1 000），兔抗大鼠GFAP 多克隆抗体（1:1 000）。然后用TBS-Tween 20 洗涤3 次，每次15 min，再与二抗山羊抗兔IgG 抗体（Bioker，1:500）室温孵育2 h。在最后的洗涤步骤后，对膜进行化学发光反应，并通过密度测定法计算个条带灰度值（Quantity One 4.2，Bio-Rad，Hercules，CA），每个实验至少进行3 次。利用Image Lab 软件对各组蛋白灰度值进行检测和量化。

2 结果

2.1 各组BDNF、GFAP 和Caspase-3 mRNA 表达水平情况比较 见表1。

表1 各组BDNF、GFAP 和Caspase-3 mRNA 表达水平情况比较（）

表1 各组BDNF、GFAP 和Caspase-3 mRNA 表达水平情况比较（）

注：与空白组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与针灸组和康复组比较，▲P ＜0.05

结果表明，与空白组比较，模型组、针灸组、康复组和针康组BDNF 和GFAP mRNA 表达水平显著增加，差异具有统计学意义；与模型组比较，针灸组、康复组和针康组BDNF 和GFAP mRNA 表达水平显著增加，差异具有统计学意义；与针灸组和康复组比较，针康组BDNF 和GFAP mRNA 表达水平显著增加，差异具有统计学意义。Caspase-3 的表达，与空白组比较，模型组、针灸组、康复组和针康组Caspase-3 mRNA 表达水平显著增加，差异具有统计学意义；与模型组比较，针灸组、康复组和针康组Caspase-3 mRNA 表达水平显著降低，差异具有统计学意义；与针灸组和康复组比较，针康组Caspase-3 mRNA 表达水平显著降低，差异具有统计学意义。

2.2 各组BDNF 蛋白表达水平情况 见图1。

图1 各组BDNF 蛋白表达水平情况

结果表明，与空白组比较，模型组BDNF 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义；与模型组比较，针灸组、康复组和针康组BDNF 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义；与针灸组和康复组比较，针康组BDNF 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义。结果提示，虽然单纯针灸或单纯康复疗法可促进神经保护蛋白表达，但是针康疗法能更好地保护缺血区受损的神经元，更利于神经元功能重建和肢体运动功能康复。

2.3 各组GFAP 蛋白表达水平情况 见图2。

图2 各组GFAP 蛋白表达水平情况

结果表明，与空白组比较，模型组GFAP 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义；与模型组比较，针灸组、康复组和针康组GFAP 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义；与针灸组和康复组比较，针康组GFAP 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义。结果提示，虽然单纯针灸或单纯康复疗法可促进神经修复功能增加，但是针康疗法能更好地促进缺血区受损神经元的修复，促进神经元功能重建和肢体运动功能康复。

2.4 各组Caspase-3 蛋白表达水平情况 见图3。

图3 各组Caspase-3 蛋白表达水平情况

结果表明，与空白组比较，模型组Caspase-3 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义；与模型组比较，针灸组、康复组和针康组Caspase-3 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义；与针灸组和康复组比较，针康组Caspase-3 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义。结果提示，虽然单纯针灸或单纯康复疗法可抑制脑细胞凋亡，促进脑细胞存活，但是针康疗法抑制脑细胞凋亡效果更显著，更能有效促进脑细胞存活。

3 讨论

脑缺血性脑血管病是临床上导致患者高死亡率和致残率常见疾病，发病诱因多样，详细发病机制未明[9-11]。脑缺血性脑血管病的发生发展与大动脉粥样硬化，心源性栓塞，全身灌注不足，穿透性动脉疾病，颈动脉夹层，高凝性遗传综合征等诸多因素有关。研究[12]表明，缺血性脑病的发生率与种族等因素相关，与白种人相比，西班牙裔和黑人具有较高的患病风险。目前治疗缺血性脑病的主要方法是及时有效地疏通阻塞的血管，溶栓、抗凝、介入等。然而，尽管有血运重建，缺血区血供改善，许多患者并不能达到良好预期的治疗效果。同时，严格的溶栓治疗时间窗（4.5 h内）限制了临床应用。立足中医经络腧穴学理论，发挥针灸、推拿等学科优势，探索有效的神经保护药物及干预方法对治疗缺血性脑病具有重要临床意义[13-15]。

脑缺血性脑血管病又因其发病突然亦称之为“卒中”，中医学认为，其病机是由于素体虚弱或饮食不节，不忌肥甘，湿遏中焦而诱发，或者积劳成疾，正气受损，又或者忧思甚骂，情志不遂，更伤中气。临床表现为突然昏仆，不省人事，或不经昏仆而以半身不遂，口舌歪斜，偏身麻木为主要症状，其证机多变，预后不佳。常伴随他症，如风之逆窜，故把此类病称之为“中风”[16-17]。穴位针刺疗法可以改善脑内血管、淋巴等循环系统，而且还可以改善大脑皮层生理电活动，属于被动治疗手段，它通过刺激经络穴位，激活周围和中枢神经系统中神经元的突触，发挥易化作用，使因脑缺血而损伤的神经通路得以正常化，促进和改善中枢及周围神经传导功能的重组[18-19]。康复疗法属于主动再学习疗法的一种，其原理可能系运动康复治疗加速了脑缺血区侧支循环的建立，促进了病灶周围或健侧脑组织的重建和代偿，充分发挥了脑的“可塑性”[20-22]，具体表现为突触的激活和“发芽”等，同时康复又可以抑制异常运动模式，促进正常运动模式的建立为目标，通过协调肌肉、韧带、关节运动向中枢提供大量本体感觉输入，发挥易化作用。针康法是针灸疗法和康复疗法的有机结合，二者相辅相成，改善了神经元代谢及信号传导，同时又恢复了腧穴经络斡旋之机，使阴阳和合、腧络贯流。

BDNF 在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统骨和软骨组织等，广泛的区域内表达；BDNF 是脑内分布最广泛的神经营养因子，BDNF 的神经营养作用非常广泛，具有对神经细胞的保护作用，主作用包括能够维持多类神经元存活并直接促进轴突生长，能够通过促进突触的可塑性促进树突和轴突的长出[6]。本研究结果表明，脑缺血区BDNF 蛋白表达显著增加，经过针灸治疗、康复治疗和针康治疗后脑缺血区BDNF 蛋白表达更加显著，尤其是针康疗法BDNF 蛋白表达量最高，结果提示，针康法较单纯针灸和单纯康复疗法疗效更佳，能更好地保护缺血区受损神经元，促进神经元功能重建和肢体运动功能康复。GFAP 是成熟和反应性星型胶质细胞的特征性标记物，正常脑内GFAP 的表达与虽形胶质细胞数量的趋势是一致的，病理上脑缺血区的GFAP 的表达增多，而且有一定的规律。而反应性AST 是对神经元损伤与修复的应答，修复损伤的神经元要通过物质交换、分泌生长因子、细胞因子、识别分子等途径，促进受损的轴突的再生。本研究结果表明，脑缺血区GFAP蛋白表达显著增加，经过针灸治疗、康复治疗和针康治疗后脑缺血区GFAP 蛋白表达更加显著，尤其是针康疗法GFAP 蛋白表达量最高，结果提示，针康法较单纯针灸和单纯康复疗法疗效更佳，能更好地促进缺血区受损神经元的修复，促进神经元功能重建和肢体运动功能康复。Caspase-3 属于白细胞介素 1β（interleukinconvertin ICE）转换酶家族，是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶。细胞凋亡的发生是一个极其复杂的、由Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，Caspase-3处于调亡的核心位置，是决定细胞凋亡的“分子开关”，活化的Caspase-3 又进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向死亡。本研究表明，脑缺血区Caspase-3 蛋白表达显著增加，提示脑细胞凋亡亢进，经过针灸治疗、康复治疗和针康治疗后脑缺血区Caspase-3 蛋白表达更加降低，尤其是针康疗法Caspase-3 蛋白表达量最低，结果提示，针康法较单纯针灸和单纯康复疗法疗效更佳，能更好地抑制缺血区受损神经元的凋亡，促进脑细胞存活，改善了肢体功能障碍，利于疾病向愈。

综上，单纯针灸或单纯康复疗法均可保护促进缺血区神经元并促进其修复功能，抑制神经细胞凋亡，促进脑细胞存活，针康疗法能更好地促进缺血区受损神经元的保护和修复，能更好地抑制脑细胞凋亡，更利于促进神经元功能重建和肢体运动功能康复，这可能是针康法治疗脑缺血性疾病，促进脑缺血神经恢复的部分机制。