杜仲黄酮对2 型糖尿病小鼠胰腺凋亡因子的影响

范春惠，张琳惠，郑 妮

（1.浙江大学医学院附属儿童医院，杭州 310000；2.南方科技大学医院，广东 深圳 518000）

2 型糖尿病（T2DM）发病机制主要是前期的胰岛素抵抗和后期的胰岛细胞功能障碍或受损凋亡[1]。随着T2DM 病程的发展，胰岛细胞数量逐渐减少，胰岛功能受损逐渐加剧，而胰腺细胞凋亡是其数量减少、胰岛素分泌功能下降的主要因素之一[2]。杜仲黄酮是杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliver）的干燥树皮中提取的主要成分。研究[3-4]表明，杜仲黄酮有良好的降糖、抗氧化应激效果，本研究基于课题组前期研究（通过尾静脉注射链脲佐菌素联合高脂高糖饮食共同诱导构建糖尿病小鼠模型）结果，探讨杜仲黄酮对T2DM 小鼠胰腺凋亡因子的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性昆明小鼠，SPF 级，体质量18～22 g，购自浙江大学实验动物中心，合格证号：SCXK（浙）2019-0023。小鼠饲养于通风良好环境，室温18～25 ℃，相对湿度40%～70%，12 h 光照昼夜循环。实验开始前小鼠进行适应性喂养1 周。

1.2 药物及试剂 盐酸二甲双胍片（京丰制药有限公司，批号：191115）；STZ（美国Sigma 公司，批号：B1863）；白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞凋亡因子Fas、可溶性细胞凋亡因子配体Fasl、C-肽、氧自由基（ROS）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20200918、20200925、20200927、20200908、20200911、20200906）；Bcl-2、Bax 一抗（英国Abcam 公司，批号：B2011、B2017）；杜仲黄酮提取：采用醇提取法提取杜仲黄酮。首先将干燥杜仲进行充分粉碎，粉碎药材置于容器中采用70%乙醇（药材:70%乙醇=1:15），在80 ℃条件下加热回流提取2 h，连续提取3 次。将提取液进行过滤浓缩，获得干燥杜仲黄酮提取物。

1.3 主要仪器 9602A-酶标仪（北京艾普生物设备有限公司）；罗氏卓越型血糖仪（瑞士ACCU-CHEK Performa）；Mini-Protean Tetra 垂直电泳仪、转膜显影设备、GelDoc EZ 凝胶电泳成像分析系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.4 方法

1.4.1 T2DM 小鼠模型建立 雄性小鼠禁食不禁水12 h，用4℃枸橼酸缓冲液（pH=7.4）溶解的STZ 溶液，尾静脉注射STZ（25 mg/kg）。注射后继续予高脂高糖饲料喂养8 周，检测小鼠空腹血糖（FBG），FBG ≥11.1 mmol/L 为T2DM 模型成功[5]。

1.4.2 分组及给药 将造模成功的T2DM 模型小鼠随机分为模型组、二甲双胍组（32 mg/kg）、杜仲黄酮低剂量组（80 mg/kg）、杜仲黄酮高剂量组（160 mg/kg），每组10 只。另以健康昆明小鼠为空白对照组。各组予相对应药物灌胃60 d，每日1 次。模型组和正常对照组小鼠予等体积生理盐水灌胃。

1.5 观察指标 末次给药后，小鼠禁食不禁水12 h，测其FBG。切取部分胰腺组织，Tunel 染色观察细胞凋亡情况。ELISA 法检测血清中空腹C-肽含量以及胰腺中炎症因子IL-6、TNF-α、跨膜蛋白Fas 及配体Fasl 含量。Western blot 检测胰腺中促进细胞凋亡因子Bax 和抑制细胞凋亡因子Bcl-2 表达。

1.6 统计学方法 采用SPSS 18.0 进行数据分析，数据以均数±标准差（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐性，采用Bonferroni法进行两两比较；若方差不齐，采用Kruska-Wallis H秩和检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠给药前后FBG 指标变化比较 与空白组比较，模型组小鼠FBG 明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，二甲双胍、杜仲黄酮组小鼠FBG 均降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠给药前后FBG 指标变化比较（，n =10）

表1 各组小鼠给药前后FBG 指标变化比较（，n =10）

注：与模型组比较，# P ＜0.05

2.2 各组小鼠胰腺组织细胞凋亡情况比较 与空白组比较，模型组小鼠胰腺有大量凋亡阳性细胞（P＜0.05）。与模型组比较，二甲双胍、杜仲黄酮组小鼠胰腺凋亡阳性细胞较模型组少（P＜0.05）。见图1。

图1 各组小鼠胰腺组织细胞凋亡情况比较

2.3 各组小鼠胰腺中炎症因子与跨膜蛋白及其配体含量比较 与空白组比较，模型组小鼠胰腺中炎症因子IL-6、TNF-α 与跨膜蛋白Fas 及其配体Fasl 的含量增加（P＜0.05）。与模型组比较，二甲双胍、杜仲黄酮组小鼠胰腺中IL-6、TNF-α、Fas、Fasl 含量减少（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠胰腺中炎症因子与跨膜蛋白及其配体含量比较（，n =10）

表2 各组小鼠胰腺中炎症因子与跨膜蛋白及其配体含量比较（，n =10）

注：与模型组比较，# P ＜0.05

2.4 各组小鼠胰岛功能及胰腺中ROS 含量变化比较 与空白组比较，模型组小鼠血清中空腹C-肽含量减少，胰腺中ROS 含量增加（P＜0.05）。与模型组比较，二甲双胍、杜仲黄酮组小鼠血清中空腹C-肽含量增加，胰腺中ROS 含量降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠胰岛功能及胰腺中ROS 含量变化比较（，n =10）

表3 各组小鼠胰岛功能及胰腺中ROS 含量变化比较（，n =10）

注：与模型组比较，# P ＜0.05

2.5 各组小鼠胰腺促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2表达比较 与空白组比较，模型组小鼠胰腺中促凋亡因子Bax 表达增加、抑凋亡因子Bcl-2 表达减少（P＜0.05）。与模型组比较，二甲双胍、杜仲黄酮组小鼠胰腺中促凋亡因子Bax 表达减少、抑凋亡因子Bcl-2表达增加（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠胰腺促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2表达比较（，n =10）

表4 各组小鼠胰腺促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2表达比较（，n =10）

注：与模型组比较，# P ＜0.05

3 讨论

胰岛细胞是机体分泌胰岛素，调控血糖的重要细胞器，其对各类应激损伤、促凋亡刺激均极度敏感，而T2DM 的发病及病程发展与胰岛细胞凋亡有关[6]。正常生理情况下，细胞凋亡是维持机体稳定，清除损伤及多余细胞的有序性死亡。其凋亡路径主要包括内质网应激途径、死亡受体介导的路径、线粒体路径、颗粒酶 B 途径等[7]。在T2DM 的发病及病程发展中，胰岛细胞凋亡的主要信号转导路径是线粒体路径[8]。Bcl-2 蛋白家族中各个蛋白及其亚型与线粒体膜相结合，在凋亡的过程中起到不同的作用。

促凋亡因子Bax 和抑凋亡因子Bcl-2 是 Bcl-2 家族中重要的凋亡的因子。Bax 与Bcl-2 的比值间接反映了细胞受凋亡因子调节的程度[9]。T2DM 状态下，Bcl-2与Bax 之间的表达平衡被破坏，胰腺细胞线粒体外膜的寡聚体转化增多，孔模形成，线粒体外膜通透性增加，促使线粒体内膜的细胞色素C 透过线粒体外膜上的孔模释放到胞质中[10]。线粒体内部细胞色素C 的外排导致其内部能量丧失，影响线粒体正常功能；细胞质中过量的细胞色素C 与凋亡蛋白酶激活因子1、Caspase-9、ATP 形成凋亡体，激活跨膜蛋白Fas 与其受体Fasl 结合，活化Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等凋亡因子，引起非蛋白溶解级联反应，使胰腺细胞解体而发生凋亡[11]。本研究结果表明，杜仲黄酮能降低糖尿病小鼠空腹血糖，减少胰腺组织中跨膜蛋白Fas配体Fasl 的含量，抑制凋亡因子Bcl-2 表达增加，促凋亡因子Bax 表达减少。

氧化应激是 T2DM 发病及病程进展的关键因素，也是导致胰岛细胞功能衰退及细胞凋亡的关键原因[12]。其通过多元醇通路、生物氧化和线粒体电子传递链等途径增加机体内的ROS 含量，造成胰腺细胞及蛋白和核酸等生物大分子损伤，细胞内的线粒体结构受损坏及功能出现障碍，直接或间接损伤胰腺β 细胞，使胰岛细胞功能下降，加速其凋亡，影响胰岛素分泌[13]。炎症是胰岛素抵抗与胰岛β 细胞凋亡的重要桥梁。T2DM状态下，胰腺β细胞内炎症相关信号通路被激活，促进各种炎症因子TNF-α、IL-6 释放，导致胰岛素抵抗或胰岛β 细胞凋亡[14-15]。本研究结果表明，杜仲黄酮能降低胰腺组织中ROS 及炎症因子TNF-α、IL-6 的含量。

综上所述，杜仲黄酮能增加血清中C-肽含量，减少胰腺中TNF-α、IL-6、ROS、Fas、Fasl含量及Bax表达，增加Bcl-2 表达，改善炎症因子及氧化应激对胰腺病理损伤，提高胰岛功能，其作用机制与杜仲黄酮通过调节线粒体凋亡途径中的相关凋亡因子及跨膜蛋白表达，减少胰腺细胞凋亡有关。