两种培养条件下重组杆状病毒表达小反刍兽疫病毒N 蛋白的丰度

师亚玲，韩佃刚，董 俊，叶玲玲，李凌枫，陈朝林，信吉阁，艾 军

（1.云南农业大学，云南昆明 650201；2.昆明海关技术 中心，云南昆明 650200）

小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的严重传染病[1]，主要感染山羊、绵羊和野生小反刍动物等[2]。该病在世界范围内备受重视，被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病[3-4]，在我国被列为一类动物疫病[5]。

PPRV 属于副黏病毒科麻疹病毒属，是不分节段的单股负链RNA 病毒，只有一个血清型[6]。该病毒基因组共编码6 种结构蛋白，依次为核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白（H）和大蛋白（L）[7-9]。其中N 蛋白是主要结构蛋白，可通过自我组装成核衣壳粒子，与P 蛋白和L 蛋白协同作用调控病毒RNA 转录和复制[10]，是病毒粒子中含量最丰富且免疫原性最强的结构蛋白[11]。PPRV 感染机体可以引起强烈的免疫反应，因此N 蛋白常被作为建立诊断、检测方法的候选抗原[12]。

昆虫杆状病毒表达系统（baculovirus expression vector system，BEVS）是以杆状病毒为载体，以昆虫细胞为受体的高效真核表达系统[13]。该系统可将外源目的基因插入杆状病毒载体中，转染入昆虫细胞对单个蛋白或者蛋白复合体进行高量表达[14]。

昆虫细胞培养常用方式有贴壁培养和悬浮培养。贴壁培养操作简单，所需资金少，便于观察细胞形态变化，是最常用且最稳定的培养方式[15]。摇瓶悬浮培养的操作和培养条件也较为简单，具有病毒产量高、产出周期短、不易被污染等优势[16]。因此本研究选用这两种方式作为重组杆状病毒培养方式。

本课题组前期已开发出基于重组昆虫杆状病毒表达PPRV N 蛋白的ELISA 抗体检测试剂盒。为优化试剂盒生产工艺，进一步获得高表达量的N蛋白，开展了贴壁培养和摇瓶悬浮培养对昆虫细胞中PPRV N 蛋白表达量影响的研究，以期为优化昆虫细胞表达PRRV N 蛋白的培养条件提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Sf9 昆虫细胞、表达PPRV N 蛋白的重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N、PPRV C-ELISA 抗体检测试剂盒（内含PPRV 单克隆抗体、HRP 标记的羊抗鼠二抗、ELISA 板、pH9.6 碳酸盐包被液、TMB显色液、1 mol/L H2SO4终止液、PBST 洗液），均由昆明海关技术中心动检实验室提供；胎牛血清，购自Biological Industries（BI）公司；Grace's 培养基，购自Gibco 公司。

1.2 细胞培养

Sf9 细胞使用含10%胎牛血清的Grace's 培养基，在27 ℃培养箱中培养。

1.3 重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N 感染Sf9 细胞

待Sf9 细胞在两瓶75 cm2细胞培养瓶长满后，换液，每瓶内加入20 mL Grace's 培养基；将细胞吹打下来后混合到一起，在显微镜下进行细胞计数，密度为2.35×105个/mL（共40 mL）；将40 mL Sf9 细胞均分至175 cm2细胞培养瓶和500 mL 摇瓶中，各加入8 mL 含有重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N 的种子病毒贮存液，然后用含2%胎牛血清的Grace′s 培养基将总体积添至80 mL/瓶；将175 cm2细胞培养瓶放 入27 ℃保温箱中进行贴壁培养，摇瓶放入转速为60 r/min，温度为27 ℃摇床中悬浮培养，总共培养120 h。

1.4 Sf9 细胞形态观察及N 蛋白表达量测定

1.4.1 Sf9 细胞形态观察 培养后24、48、72、96、120 h，分别用显微镜观察并拍照记录两种培养条件下Sf9 细胞形态变化。

1.4.2 N 蛋白表达量测定 病毒培养24、48、72、96、120 h 后，在无菌条件下分别从细胞培养瓶和摇 瓶中吸取500 μL 病毒培养液，同时吸取500 μL 重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N 种子病毒液作为对照，分别装于1.5 mL 离心管中，用间接ELISA 检测PPRV N 蛋白表达量。每个样品做8 个重复，最后的数值取平均值±标准差（x±SD）。具体步骤：将吸取的病毒液，用pH9.6 碳酸盐包被液按体积比1:10 进行稀释；每孔加入100 μL 稀释液包被ELISA 板，37 ℃作用1 h，洗板3 次，将洗涤液拍干；在ELISA 板中每孔加入100 μL 固定浓度PPRV 单克隆抗体，37 ℃作用1 h，洗板3 次，将洗涤液拍干；在ELISA 板中每孔加入100 μL 固定浓度HRP 标记的羊抗鼠二抗，37 ℃作用1 h，洗板3 次，将洗涤液拍干；以TMB 显色，1 mol/L H2SO4终止显色，读取450 nm 吸光值（OD450nm）。根据OD450nm判定PPRV N 蛋白表达量，OD450nm大小与表达蛋白含量成正比，OD450nm越高间接反映蛋白表达量越高。

1.5 数据分析

试验数据用SPSS 19.0 统计软件进行分析。数据以x±SD 表示，采用方差Duncan法分析不同培养时间蛋白表达量之间的差异显著性，用Excel 软件制作折线图。

2 结果

2.1 细胞形态变化

2.1.1 细胞培养瓶贴壁培养 感染重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N 后，Sf9 细胞在细胞培养瓶中贴壁培养形态随时间变化如图1。结果显示：在感染重组杆状病毒后24～48 h，Sf9 细胞形态为大小均匀的圆形，细胞透亮，折光性好，细胞数量较多；72 h 后，Sf9 细胞随着PPRV N 蛋白在胞内累积，细胞形态开始逐渐变化，一些细胞变大，出现细胞大小不均匀现象，细胞折光性变差；从感染后96 h开始，显微镜下具有完整形态的细胞数量减少，出现细胞碎片；至感染后120 h，细胞培养瓶内只存在少数圆形细胞和大部分非细胞形态碎片。

2.1.2 摇瓶悬浮培养 感染重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N 后，Sf9 细胞在摇瓶中悬浮培养形态随时间变化如图2。结果显示：在感染重组杆状病毒后24～48 h，Sf9 细胞大小均匀，形状规则为圆形，细胞透亮，折光性好，细胞数量较多；随着N 蛋白在胞内累积，细胞形态逐渐变化，细胞大小变得不均匀，折光性变差，数量逐渐减少；至72～96 h，形态完整可见的细胞数量明显减少，出现很多细胞碎片；感染后120 h，只可见到极少数的圆形细胞，其他均为非细胞形态碎片。

2.2 PPRV N 蛋白表达量测定

2.2.1 细胞培养瓶贴壁培养 表1 记录了病毒培养不同时间点（24～120 h）从贴壁培养细胞瓶中吸取的样品和重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N 种子病毒液测得的吸光度值（OD450nm）。由SPSS 软件进行数据分析可知，种子病毒液中N 蛋白含量与培养后24、48 h 表达N 蛋白量相比，无显著性差异（P＞0.05）；培养72 h 与48 h 相比，N 蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；培养96 h 与72 h 相比，蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；培养120 h 与96 h 相比，蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；蛋白表达量从培养后48 h 开始快速增长，到120 h 时达到高峰。

表1 贴壁培养重组杆状病毒不同时间点PRRV N 蛋白表达量（吸光度值测定）

2.2.2 摇瓶悬浮培养 表2 记录了病毒培养不同时间点（24～120 h）从悬浮培养摇瓶中吸取的样品和重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N 种子病毒液测得的吸光度值（OD450nm）。根据数据分析可知，种子病毒液中N 蛋白含量与培养后24、48 h 相比，无显著性差异（P＞0.05）；培养72 h 与48 h 相比，蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；培养96 h 与72 h、120 h 相比，蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；N 蛋白从第48 h 开始快速增长，到96 h 蛋白表达量达到最高峰，120 h 蛋白表达量开始下降。

表2 悬浮培养重组杆状病毒不同时间点PRRV N 蛋白表达量（吸光度值测定）

2.2.3 不同培养条件下N 蛋白表达量动态变化比较 由图3 可知，在细胞培养瓶贴壁培养和摇瓶悬浮培养条件下，PRRV N 蛋白表达量在培养24～48 h时均变化不大，48～120 h 时显著上升；随着培养时间延长，96 h 摇瓶悬浮培养条件下N 蛋白表达量高于贴壁培养，120 h 二者趋于一致。

3 讨论

PPR 是由PPRV 引起的小反刍动物的临床以发热、口炎、腹泻和肺炎为主要特征的一种急性高度接触性传染病。感染后，羊的发病率和病死率分别高达100%和90%[17]。PPR 传入我国后，对西南边境省份的养羊业构成了严重威胁[18]。本研究基于昆虫杆状病毒表达系统优于原核表达系统的优点（表达外源蛋白时具有完备的翻译后加工修饰能力）[19]，开展了PPRV N 蛋白在昆虫细胞中表达量的有关分析，可为后续建立基于N 蛋白的PPRV检测方法奠定基础。

ELISA 是最常用的血清学检测方法。20 世纪80 年代，国外已先后报道了蓝舌病病毒间接ELISA、阻断ELISA、竞争性ELISA 检测方法的建立[20]。本研究是将重组杆状病毒在Sf9 昆虫细胞上表达的PPRV N 蛋白包被到ELISA 板上，使用固定浓度的PPRV 单克隆抗体、HRP 标记的羊抗鼠二抗，评估N 蛋白表达量。从图3 可以看出，昆虫细胞在贴壁培养和摇瓶培养两种条件下，二者达到表达量最高的时间不同。Sf9 昆虫细胞形态变化显示，培养96～120 h 细胞数量明显减少，细胞碎片增加。推测过程为重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N 在培养24～48 h 时侵染细胞，然后病毒增殖，表达N 蛋白，在72 h 时部分细胞破碎，释放出大量N 蛋白，因此72 h 时蛋白表达量明显增多，而96 h 和120 h 后，破碎的细胞更多，摇瓶悬浮培养的昆虫细胞蛋白表达量在96 h 达到最高峰，120 h蛋白表达量开始下降；贴壁培养的昆虫细胞蛋白表达量在120 h 达到最高峰。摇瓶培养的昆虫细胞中N 蛋白96 h 表达量更高，则可能是由于摇瓶培养的细胞与重组杆状病毒Vbacmin-PPRV-N 的接触面积更大，细胞更容易被感染，也更容易破碎，从而释放出大量N 蛋白。本研究可为优化昆虫细胞表达PRRV N 蛋白的培养条件提供参考。