小反刍兽疫病毒抗体ELISA 试验测量不确定度评估

王治维，图门巴雅尔，孙 娜，胡明明，孙 杰，宁 艳，雷 冲，王 锦，赵 凯，张 昱，雷宇平，陈 勇，王仲兵

（1.山西省动物疫病预防控制中心，山西太原 030027；2.山西农业大学，山西晋中 03080 1；3.磐石市农业综合行政执法大队，吉林磐石 132300）

测量不确定度简称不确定度，是指根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数（JJF 1059.1—2012）或表示与测量结果相关联的参数，表征合理地赋予被测量值的分散性（CNASGL043：2020）[1-2]。其本质为表征结果的分散性，根据计算公式，其必然为非负数。具体而言，不确定度包括由系统影响引起的若干分量。测量结果包括估计值和测量不确定度，而不确定度反映了测量结果的可信程度[3]。

ELISA 试验因操作相对简便，检测敏感性和特异性较高，成为近年来兽医系统实验室常用的检测方法之一。随着检测实验室认证认可要求的提高，测量不确定度评估在兽医实验室越来越被接受及应用。口蹄疫、禽白血病抗体ELISA 检测已经开展了相应测量不确定度评估[4-5]。

本研究利用ELISA 试验测定小反刍兽疫病毒（PPRV）抗体，并对测量不确定度进行了评定和计算，提供了测量过程中各分量的组成和计算方法，科学评定了此方法的准确性，以期为兽医实验室测量不确定度评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与试剂 PPRV 阻断ELISA 抗体检测试剂盒（批号20200701），购自武汉科前生物股份有限公司，包括试剂盒自带的阴性和阳性对照样品；5 份待测羊血清样品，来源于山西省动物疫病预防控制中心兽医实验室，均为留样样品，其中3份阳性、2 份阴性。

1.1.2 主要仪器酶标仪（型 号CYTATION5），为美国BioTek 公司产品；移液器（量程20～200 μL），为Eppendorf 公司产品；恒温培养箱（型号SPX-150B III），为天津泰斯仪器有限公司产品。

1.2 检测方法

按照《小反刍兽疫诊断技术》（GB/T 27982—2011），应用ELISA 试验检测血清中PPRV 抗体。

2 结果及分析

2.1 被测量的数学模型

根据试剂盒说明书中提供的公式进行计算和判定。被测量的数学模型为PB=（1-S/N）×100%。式中，PB 为阻断率，S和N分别为样品和阴性对照在450 nm 波长处的吸光度（OD450nm）。

2.2 不确定度来源分析

根据检测的方法原理，影响不确定度的因素有移液器、加样时间、孵育温度、孵育时间、试剂盒质量和酶标仪精度等。对各不确定度分量的来源进行分析并建立相应数学模型，此试验不确定度分量的来源主要为样品（T）和阴性对照（N）的不确定度，分别由uT、uN表示。

2.2.1uT的来源 根据检测原理及试剂盒说明书，样品（T）OD450nm的不确定度分量有：孔间试剂OD450nm的不确定度（uT1）；样品加样量带入的不确定度（uT2），包括移液器相对误差、加样量、温度效应分别引入的不确定度uT2-1、uT2-2、uT2-3；样品加样时间带入的不确定度（uT3）；酶标仪带入的测量不确定度（uT4），包括OD450nm值准确度、重复性引入的不确定度uT4-1、uT4-2以及校准酶标仪时所使用的标准物质引入的不确定度uT4-3；孵育时间引入的不确定度（uT5），包括第1 次孵育60 min、第2 次孵育30 min 引入的不确定度uT5-1、uT5-2；孵育温度引入的不确定度（uT6），包括第1、2 次孵育引入的不确定度uT6-1、uT6-2。

2.2.2uN的来源 主要包括阴性对照（N）OD450nm重复性引入的不确定度uN-1以及酶标仪的测量不确定度uT4。

2.3 测量不确定度分量评定

2.3.1 孔间试剂吸光度值不确定度（uT1）试剂反应孔间的不确定度可通过实验室试验获得，结果见表1。依据JJF 1059.1—2012 中A 类合并样本标准差的方法，取m=5，可得到试剂孔间OD450nm的标准不确定度：

表1 批内精密性数据

2.3.2 样品加样量引入的不确定度（uT2）

2.3.2.1 移液器相对误差引入的不确定度（uT2-1）移液器校准证书中在100 μL 量程处的RE（relative error，相对误差）为0.2%。根据JJF 1059.1—2012，进行B 类不确定度评定，假设移液器的误差均匀分布，即等概率地落在区间内，uT2-1=a/k，k=根据公式可得出移液器100 μL 量程处的RE 引入的不确定度为0.115 μL。同理，50 μL 量程处的RE 为0.3%（按照0.2%～0.4%平均值计算），可得出uT2-1-1=0.086 6 μL。

2.3.2.2 移液器加样引入的不确定度（uT2-2）根据移液器100 μL 量程处的相关数据，其准确度为2%，试验中每次的加样量为100 μL，按照矩形分布，移液器加样引入的标准不确定度uT2-2=（100 μL×2%）=1.15 μL。同理，50 μL 量程的准确度为3%（按照2%～4%平均值计算），ELISA试验中加样量为50 μL，按照矩形分布，移液器加样引入的标准不确定度uT2-2-1=（50 μL×3%）=0.866 μL。

2.3.2.3 移液器温度效应引入的不确定度（uT2-3）容量器皿在20 ℃被校准，根据实验室实际工作温度在（20±4）℃波动，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，按照矩形分布，在100 μL 量程处移液器由温度效应引入的标准不确定度uT2-3=100×4×2.1×10-4=0.084 μL，在50 μL 量程处的标准不确定度uT2-3-1=50×4×2.1×10-4=0.042 μL。

2.3.3 样品加样时间引入的不确定度（uT3）每次检测的样品加样时间不超过10 min，假设样品的加样时间等概率落在0～10 min 区间内，则uT3=a/k=（10/2）=2.887 min。

2.3.4 酶标仪引入的测量不确定度（uT4）根据CYTATION5 酶标仪的校准证书，OD450nm准确度为±0.005，OD450nm测量重复性为0.1%（技术要求为≤1.0%）。假设酶标仪测量的OD450nm重复性均匀分布，可得出OD450nm准确度引入的不确定度uT4-1=a/k=（0.005/2）=0.001；OD450nm重复性引入的不确定度uT4-2=a/k=（1×0.1%/2）=0.000 3；酶标仪的校准证书给出检定用标准物质的吸光度U=0.01A（k=2），则标准物质引入的标准不确定度uT4-3=a/k=0.006。

2.3.5 孵育时间引入的测量不确定度（uT5）根据ELISA 试剂盒说明书，试验中孵育时间分别为（60±3）min 和（30±3）min，按照均匀分布计算，标准差==1.732 min。uT5=

2.3.6 孵育温度引入的测量不确定度（uT6）根据ELISA 试剂盒说明书，试验中孵育温度均为（37±t）℃，根据均匀分布计算，其标准差为=±1 ℃，所以孵育温度的相对不确定度uT6=

2.3.7 阴性对照吸光度值引入的不确定度（uN）本研究设置19 个阴性对照，阴性对照OD450nm及SD值见表2。根据贝塞尔公式，计算出阴性对照的标准不确定度uN-1==0.071。阴性对照引入的不确定度（uN）由重复性不确定度uN-1及uT4两个分量组成，因此

表2 阴性对照及阳性对照孔数据

2.4 合成标准不确定度评定

2.4.1 样品加样量引入的合成标准不确定度（uT2）对于ELISA 试验，测定OD 时，样品孔中液层由底物溶液（V底）和终止液（V终）组成，加入100 μL底物（V底）引起的标准合成不确定度u（V底）==1.159 μL。同理，加入50 μL终止液（V终）引入的标准合成不确定度u（V终）==0.871 μL。因为u（V底）和u（V终）是两个相互独立的分量，由加样量引入的合成标准不确定度uT2=

2.4.2 酶标仪引入的合成标准不确定度（uT4）由于各分量互不相关，故酶标仪的测量标准不确定度0.006 09。

2.4.3 检测样品OD450nm的合成不确定度（uT）根据经验值确定：（1）样品加样量每±1 μL，样品（T）的吸光度值±0.020，故uT2灵敏系数为0.020；（2）样品加样时间每±1 min，样品（T）的吸光度值±0.010，故uT3的灵敏系数为0.010；（3）样品孵育时间每±1 min，样品（T）的吸光度值±0.012，故uT5的灵敏系数为0.012；（4）样品孵育温度每±1 ℃，样品（T）的吸光度值±0.001，故uT6的灵敏系数为0.001。检测样品（T）OD450nm的不确定度（uT）分量见表3。因各分量互不相关，均相互独立，合成检测样品（T）OD450nm的标准不确定度uT=0.086 3。

表3 检测样品（T）OD450nm 的不确定度评定一览表

2.4.4 合成样品（T）OD450nm与阴性对照的比值（S/N）的不确定度（uS/N）根据公式uS/N=，经过计算，（1）样品OD450nm引入的不确定度的灵敏系数为0.011；（2）阴性对照OD450nm引入的不确定度的灵敏系数为0.11。本研究中样品的OD450nm为0.168，阴性对照的OD450nm均值为1.531，S/N值为89.03%。S/N值的标准不确定度uS/N

2.5 扩展不确定度评定

取k=2，则uS/N的扩展不确定度U=ku=1.36%（k=2）。

3 讨论

不确定度表征被测量值可能出现的范围，代表着测量结果质量。测量结果附上不确定度才更完整、有意义。ELISA 试验引入不确定度后，提升了测量结果的可信性，有效降低了误判风险。本研究中，根据ELISA 抗体检测试剂盒说明书中判定标准，若PB ≥50%，则判定为PPRV 抗体阳性；若PB ＜50%，则判定为PPRV 抗体阴性。若考虑其测量不确定度对结果的影响，则PB±U≥50%，判定为PPRV 抗体阳性；PB±U＜50%，判定为PPRV 抗体阴性。这一研究表明，在PB±U区间内样品应判定为阳性，可有效减少假阴性样品出现概率，有助于精确评估免疫效果，避免过度免疫；也有助于小反刍兽疫退出强制免疫的评估。杜鹃[4]研究了口蹄疫病毒O型抗体测量不确定度的引入，并分析了各不确定度分量在整体不确定度值中所占的比例，有效降低了假阳性、假阴性结果的出现概率，抗体效价判定更为准确。李雪莲等[5]将测量不确定度引入ELISA检测活疫苗中病毒污染研究，对生产使用真正纯净疫苗具有重要意义。史喜菊等[6]在牛布鲁氏菌补体结合试验中引入测量不确定度，提高了测量结果质量。因此，研究不同试验方法的测量不确定度，可以逐步构建动物疫病检测领域试验的不确定度评定体系。

通过对构成不确定度的各分量进行详细分析，并分析各分量在整体不确定度值中所占的比例，可直观了解对检测结果质量影响最大的因素，在对这些因素针对性地改进后，可以有效提高检测质量。本研究中，影响ELISA 检测结果质量的主要因素为试剂孔间吸光度值和酶标仪的测量。可以通过严格按照酶标仪相关规程进行核查和维护，合理利用校准数据来降低酶标仪引入的不确定度。因ELISA试验中孔间OD 值引入的不确定度很难进行较大改善，只能通过选用敏感性、特异性等更好的试剂进一步减小不确定度。