基于响应面法优化黑参酸乳工艺研究

尹智彦，韩 梅，林红梅，杨利民

（吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118）

功能性食品是指具有特定营养保健功能的食品，被誉为“21世纪食品”。酸奶作为一款发酵乳制品，因具有改善睡眠[1]、维护肠道菌群的生态平衡[2]等功效而受到消费者的青睐。黑参作为人参炮制品，经九蒸九晒工艺所得。转变为黑参的生晒参，不仅表面色泽有所改变，其有效成分和药理活性也发生了变化，形成特有皂苷。研究发现，黑参中的单体皂苷Rg5具有使乳腺癌细胞凋亡[3]和保护心功能的潜力[4]，并且Park等[5]就黑参对饮食诱导的肥胖小鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的影响研究发现，黑参可能为预防NAFLD的一种潜在药物。基于黑参特有的活性成分，以及保健品消费市场的扩大，黑参食品种类也有所增多。高雪峰等[6]以20%黑参浓缩液、30%桑椹浓缩液、10%黄精浓缩液和20%蜂蜜研制出一款新型黑参饮品，该产品不仅具有黑参与桑椹的混合香味，并且营养价值高，可作为一款日常饮品。郭劲廷等[7]以黑参和黑蒜为原料，研制了一款营养丰富且受大众喜爱的天然抗疲劳饮料。本研究通过单因素试验、Plackett-Burman（PB）试验及Box-Benhnken（BBD）响应面试验研制黑参酸乳，以期促进人参及其炮制品在食品领域的应用，同时将中草药的有效成分与具有保健功能的酸奶相结合，为新型保健品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

黑参：选取根须完整的生晒参，参考乔雪[8]的黑参炮制工艺制得；菌粉：10菌型（由保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、开菲尔菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌等加麦芽糊精混合组成），昆山佰生优生物科技有限公司；白砂糖、牛奶、矿泉水，均为市售。

石英砂、无水乙醇、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、盐酸、乙酸锌、亚铁氰化钾、冰乙酸、酒石酸钾钠、氯化钠、甲醇、乙腈（色谱纯），结晶紫中性红胆盐琼脂、MRS培养基、MC培养基（海博生物）、改良MRS微生物检测配套试剂，广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

K9860型全自动凯氏定氮仪、DL-820E型智能超声波清洗器，上海之信仪器有限公司；AUY220型电子天平，日本岛津公司；GZX-9070 MBE型数显鼓风干燥箱、HH-6型数显恒温水浴锅、GI54DWS型高压蒸汽灭菌锅，厦门致微仪器有限公司；PharmaSpec UV-1700型可见分光光度计、1260 infinityⅡ型高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

纯牛奶300 mL→预热（60℃、3 min）→冷却后加入混匀的白砂糖及黑参粉→均质（均质带）充分混匀→灭菌（60℃，30 min）→冷却→添加菌粉→恒温发酵→后熟（4℃，12 h）→成品

1.2.2 单因素试验设计

结合大量文献与预试验初步确定黑参酸乳的工艺基础条件为：1.5 g黑参粉，1.0 g菌粉，24 g白砂糖，于39℃发酵6 h。在此基础上选取不同黑参粉添加量（1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 g）、菌粉添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g）、白砂糖添加量（6、12、18、24、30、36 g）、发酵时间（4、6、8、10、12、14 h）及发酵温度（35、37、39、41、43、45℃）进行单因素试验，采用主成分分析法对酸乳脂肪、微生物和感官品质评分等9个生化指标进行综合分析，从而确定各因素的适宜值。

1.2.3 Plackett-Burman试验设计

将菌粉添加量、白砂糖添加量、黑参粉添加量、发酵时间和发酵温度作为考察因素，感官品质评分作为响应值，进行Plackett-Burman试验并设计高低2个水平，试验因素水平参见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素水平表Table 1 Plackett-Burman test factors and levels table

1.2.4 响应面试验设计

以单因素和PB试验为基础，将因素发酵温度（A）、黑参粉添加量（B）和白砂糖添加量（C）作为自变量，感官评分（Y）作为因变量进行BBD试验，因素水平见表2。

表2 BBD试验因素水平表Table 2 BBD test factors and levels table

1.2.5 测定项目与方法

1.2.5.1 理化指标

脂肪含量：参照GB 5009.6—2016[9]中的方法测定；蔗糖含量：参照GB 5009.8—2016[10]中的方法测定；酸度：参照GB 5413.34—2010[11]中的方法测定；蛋白质含量：参照GB 5009.5—2016[12]中的方法测定；持水力：参考毕宇[13]的测定方法；非脂乳固体含量：参照GB 5413.39—2010[14]中的方法测定。

1.2.5.2 微生物指标

参照GB 4789.35—2016[15]中的方法测定。

1.2.5.3 人参皂苷

采用超声提取-高效液相色谱法[16]测定。样品前处理：精密称取30 mL人参粉水溶液（7.2 g黑参粉加入300 mL水中）或人参酸乳置于锥形瓶中，加入30 mL甲醇，90 Hz超声提取30 min，将上层清液过滤，重复3次，合并滤液，转移至蒸发皿中，于60℃水浴蒸发，定容至5 mL棕色容量瓶，过0.22μm针孔滤膜，用于高效液相检测，每个样品重复3次。

1.2.6 感官品质评价

由10位同学组成感官评定小组，根据表3分别对黑参酸乳的色泽、组织状态、滋味和气味进行综合评分。将酸乳从冰箱取出，静置15 min后取适量置于透明杯中，于自然光下观察其色泽和组织状态，闻其味后用温开水漱口品其味，并根据标准进行评分，结果取平均值。

表3 黑参酸奶感官品质评分标准Table 3 Sensory scoring criteria of black ginseng yoghurt

1.2.7 数据处理

应用IBM SPSS Statistics 25.0进行主成分分析，Design-Expert 8.0.6进行Plackett-Burman试验和Box-Benhnken试验的设计、分析，应用WPS Office绘制图表。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 白砂糖添加量的筛选

主成分分析是利用降维的方式，在保证数据损失最少的前提下，将多个指标转化为少数综合指标的一种多变量数据的最佳综合简化的统计方法[17]。由表4可知，对不同白砂糖添加量酸乳的生化指标进行主成分分析后，前2个主成分的累积贡献率达到89.97%，即能够解释89.97%的信息。其中主成分1的贡献率为57.28%，特征值为5.16；主成分2的贡献率为32.69%，特征值为2.94。在表4的基础上根据综合指标的隶属函数值、权重求得各添加量的综合评价值，综合评价值（D值）越高产品品质越好，各单因素的适宜添加量均按此方法计算。根据图1可知，确定36 g白砂糖为适宜添加量。

图1 不同白砂糖添加量综合评价值Fig.1 Comprehensive evaluation values of different white granulated sugar additions

2.1.2 菌粉添加量的筛选

由表5可知，主成分1和主成分2的贡献率分别为51.03%、27.92%，特征值分别为4.59和2.51，其中主成分1所占比重较大，代表了脂肪、持水力、蔗糖、蛋白质、乳杆菌和感官评分。根据图2综合评价值的大小，将1.0 g菌粉确定为适宜添加量。

图2 不同菌粉添加量的综合评价值Fig.2 Comprehensive evaluation values of different bacterial powder additions

表5 不同菌粉添加量各综合指标系数及贡献率Table 5 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different bacterial powder additions

2.1.3 发酵温度的筛选

如表6所示，主成分1的贡献率为48.19%，主成分2的贡献率为34.21%，由二者可知不同发酵温度对于蛋白质、持水力、嗜热链球菌以及乳杆菌有较大的影响。根据图3确定选择39℃为适宜发酵温度。

图3 不同发酵温度综合评价值Fig.3 Comprehensive evaluation values of different fermentation temperatures

表6 不同发酵温度各综合指标系数及贡献率Table 6 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different fermentation temperatures

2.1.4 发酵时间的筛选

由表7可知，主成分1和主成分2的贡献率分别为56.25%和21.83%，累积贡献率达到78.08%。主成分1代表了酸度、持水力、蔗糖、嗜热链球菌、双歧杆菌、乳杆菌和感官评分。根据图4的综合评价值，将10 h确定为适宜发酵时间。

图4 不同发酵时间综合评价值Fig.4 Comprehensive evaluation values of different fermentation time

表7 不同发酵时间各综合指标系数及贡献率Table 7 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different fermentation time

2.1.5 黑参粉添加量的筛选

如表8所示，主成分1、主成分2和主成分3的贡献率分别为43.68%、24.81%和13.83%，其中主成分1和主成分2所占比重较大，可知不同黑参粉添加量对于酸度、乳杆菌、持水力、蛋白质和感官评分有较大影响。根据图5确定适宜黑参粉添加量为7.5 g。

图5 不同黑参粉添加量综合评价值Fig.5 Comprehensive evaluation values of different black ginseng powder additions

表8 不同黑参粉添加量各综合指标系数及贡献率Table 8 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different black ginseng powder additions

2.2 Plackett-Burman试验结果

PB试验设计及结果见表9，方差分析见表10。由表10可知，该模型的P＜0.05，达到显著水平，表明该模型具有统计学意义。发酵温度和黑参粉添加量的P值分别为0.019 3和0.020 8，表明该因素对酸乳品质影响显著（P＜0.05）。根据P值进行显著性排序：发酵温度＞黑参粉添加量＞白砂糖添加量＞发酵时间＞菌粉添加量。结合单因素试验结果及各因素的P值大小，综合选择发酵温度、黑参粉添加量和白砂糖添加量进行响应面试验。

表9 Plackett-Burman试验设计及结果Table 9 Plackett-Burman test design and results

表10 Plackett-Burman试验结果方差分析Table 10 Variance analysis of Plackett-Burman test results

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 响应面试验结果与分析

将因素A、B和C作为自变量，感官品质评分为因变量进行响应面试验，试验结果如表11所示。通过分析得出方程Y=86.30+1.99A-0.075B-0.24C-1.55AB-0.98AC+0.6BC-2.46A2-2.79B2-2.21C2。由表12可知，模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.149 5），表明模型误差较小。模型R2=0.977 2，R2adj=0.947 9，表明模型拟合度较高，可以解释94.79%响应值的变化，适用于黑参酸乳发酵工艺的优化。

表11 响应面试验设计与结果Table 11 BBD test design and results

表12 响应面试验结果方差分析Table 12 Variance analysis of BBD experiment results

2.3.2 各因素交互作用的响应面分析

响应面图和等高线图可进一步反映因素间交互作用对酸乳感官品质的影响。由图6可知，响应曲面皆开口向下，表明试验范围内的感官品质评分呈现先增大后减小的趋势，并且等高线图基本呈椭圆形，表明因素A与B、A与C间的交互作用显著，且等高线中心也位于考察区域中心，表明回归方程具有极大值。

图6 各因素交互作用对黑参酸乳感官品质影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots showing the interaction effects of different factors on the sensory qualities of black ginseng yogurt

2.3.3 最佳工艺验证试验结果

根据响应面试验结果得到黑参酸乳的预测工艺条件及感官品质评分的预测值，即黑参粉7.24 g、白砂糖34.89 g，于39.99℃下发酵，酸乳的感官评分预测值为86.919 4分。结合实际情况，将条件调整为黑参粉7.2 g、白砂糖34.9 g、发酵温度41℃，并进行3次验证试验，该工艺所得酸乳不仅口感细腻、酸甜适宜，且具有类似于咖啡的滋味和色泽。黑参酸乳的实际评分值与预测值相近，为86.5分，表明响应面结果具有较高的可信度及应用价值。

2.4 产品品质评价

将同条件下未添加参粉的酸乳作为对照（CK），与黑参酸乳进行品质对比。由表13可知，黑参酸乳的脂肪含量为3.89 g/100 g（＞3.1 g/100 g），蛋白质含量为3.23 g/100 g（＞2.9 g/100 g），蔗糖含量为10.50 g/100 g，非脂乳固体含量为9.33 g/100 g（＞8.1 g/100 g），酸度为92°T（＞70°T），相较于对照，黑参酸乳的营养成分有所增加，但增幅较小。综上所述，黑参酸乳的理化指标不仅高于我国发酵乳食品安全标准，而且优于同等条件下的对照酸乳。可见，黑参酸乳的营养价值有所提高，并且黑参粉的添加赋予了酸乳额外的健康特性。

表13 黑参酸乳理化指标对比Table 13 Comparison of physicochemical indicators in black ginseng yogurt

益生菌为已确认功效因子，主要为乳酸菌类。由表14可知，黑参酸乳的嗜热链球菌数、双歧杆菌数和乳杆菌数分别为2.67×109CFU/mL、5.30×108CFU/mL和3.45×106CFU/mL，而对照酸乳的嗜热链球菌数、双歧杆菌数和乳杆菌数为9.40×108CFU/mL、3.30×108CFU/mL和1.15×106CFU/mL，黑参酸乳的益生菌数不仅达到国家标准且显著高于标准量。相较于对照，黑参酸乳的含菌量均极显著增加（P＜0.01），其中嗜热链球菌数,相较对照增加了184.04%，与梁海艳[18]和王银平[19]在人参酸奶的研究中得到的结果相同。黑参酸乳中益生菌的增加，可能是黑参含有的营养物质为益生菌的增殖提供了能量。

表14 黑参酸乳微生物数对比Table 14 Comparison of microbial numbers in black ginseng yogurt

2.5 酸乳皂苷含量

人参皂苷为人参主要药效成分，具有抗抑郁、促进皮肤创伤组织修复等功效。如表15所示，黑参水溶液的皂苷种类包括Rf、Rd、Rb3、Rg3和Rh2，皂苷含量分别为0.08、0.89、0.66、2.81、0.10 mg/g。黑参酸乳中的皂苷种类包括Rf、Rb3、Rg3、Rh2和Rd，皂苷含量分别为0.03、0.39、2.50、0.07、0.95 mg/g。发酵前后的皂苷变化可能与益生菌中存在的某些酶类有关[20]。陈丽艳等[21]在人参豆豉发酵工艺以及人参皂苷的生物转化研究中也发现微生物发酵可实现多种人参皂苷的体外转化，转化率达60%以上。

表15 皂苷含量对比Table 15 Comparison of ginsenoside contents 单位：mg·g-1

3 结论与讨论

本研究以黑参为原料，通过添加白砂糖和菌粉经恒温发酵得到一款黑参酸乳。在单因素试验的基础上，利用Plackett-Burman试验和Box-Behnken试验得到酸乳优化工艺为：黑参粉7.2 g，白砂糖34.9 g，菌粉1.0 g，发酵温度41℃，发酵时间10 h。

本试验将黑参与酸乳结合研制黑参酸乳，其各项生化指标均符合发酵乳国家标准，而且兼具中药活性成分，增加了酸乳的营养保健价值，为人参及其制品的进一步开发利用提供了理论依据。根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》规定人参食用量为≤3 g/d，因此建议黑参酸乳的推荐食用量≤120 mL/d。孕妇、哺乳期妇女及14周岁以下的儿童不宜食用。