基于网络药理学和分子对接探究黄芪-女贞子治疗免疫缺陷病的作用机制

赵志恒，毕经会，叶诗洁，黄永康，闵 婷，王宏勋,3，王丽梅,3,

（1.武汉轻工大学生命科学与技术学院，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023；3.湖北省生鲜食品工程技术研究中心，湖北武汉 430023）

免疫缺陷病（Immunodeficiency Disease, IDD）是由遗传或者后天因素造成免疫系统受损，表现为免疫力低下，可使患者发生感染、肿瘤等恶性疾病的几率大大增加。由遗传因素引发的称为原发性免疫缺陷病，主要由基因突变引发，包含STAT1、RAC2、IL6R等400 多种基因缺陷或突变[1]。获得性免疫缺陷病多由病毒、恶性肿瘤、感染等后天性因素导致免疫功能出现暂时或永久性的损伤，如艾滋病。目前，针对免疫缺陷的治疗手段如干细胞移植、免疫球蛋白替代疗法以及抗病毒疗法等可提高患者生存率，但治疗费用昂贵，且相关技术手段不够成熟[2-3]。

黄芪和女贞子既是传统中医药又均被卫生部列入保健食品目录，因具有良好的补益作用和丰富的营养价值，民间将其作为药膳来应用，可用于治疗免疫力低下，促进正常免疫功能的恢复，辅助治疗由肿瘤或其他疾病引起的虚损[4-5]。有研究指出黄芪-女贞子联合高效抗逆转录疗法能更好地帮助艾滋病患者的免疫系统重建，能够提高T细胞免疫水平，起到增强疗效的作用，并可降低患者的骨髓抑制发生率[6-7]。黄芪-女贞子含有的黄酮、多糖、皂苷、三萜、环烯醚萜等活性成分，对免疫系统有诸多调节功能，能够增强体液免疫和细胞免疫等能力[8-9]，在治疗IDD上具有很大的潜力，但黄芪、女贞子治疗IDD的具体机制尚未明确。

网络药理学结合计算机分析、生物信息学等多学科，通过构建网络分析各种化合物与网络中关键节点之间的关系以此显示中药的物质基础和作用机制，其整体性和系统性与中药多个成分作用不同靶点特点基本吻合[10-11]。本研究拟通过网络药理学筛选黄芪-女贞子干预IDD的潜在成分和作用靶点，分析潜在靶点参与的生物过程和通路，来解释黄芪-女贞子辅助治疗IDD的作用机制。为开发IDD患者膳食补充剂提供理论依据。

1 研究方法

1.1 黄芪-女贞子活性成分筛选

在中药系统药理数据库及分析平台TCMSP数据库[12]中搜集黄芪-女贞子中化学成分，以OB≥30%，DL≥0.18（OB：口服生物利用度，DL：类药性）作为标准来搜集活性化合物，同时查找相关文献对没入选但有相关活性研究的成分进行补充，以此建立黄芪-女贞子活性成分数据库。

1.2 活性成分靶点预测及疾病靶点搜集

各个活性成分.mol2格式文件来源于TCMSP数据库，然后转化为SMILES文件，TCMSP数据库未检索到的化合物到PubChem数据库下载SDF文件，再在Swiss Tagert Prediction数据库[13]上传各活性成分SMILES或SDF文件预测各化合物靶点（Probability＞0），并以此建立黄芪-女贞子的活性成分靶点文件，在GeneCards数据库查找“Immunodeficiency disease”搜集相关靶点（Relevance score＞20）。将活性成分预测靶点与疾病靶点绘制韦恩图取交集为黄芪-女贞子治疗IDD的潜在靶点。

1.3 “活性成分-靶点-疾病”网络图的构建

获取来的活性成分、潜在靶点和疾病靶点信息借助Cytoscape_v3.7.1将三者之间的关系构建成网络图来阐述黄芪-女贞子治疗IDD的有效机制。

1.4 蛋白互作（PPI）网络构建

在STRING数据库中检索黄芪-女贞子治疗IDD 的潜在81 个靶点，设置目标为智人（Homo sapiens），选择置信度“evidence”，相互作用评分大于0.9，隐藏游离节点，找到TSV文件并下载，用Cytoscape_v3.7.1打开进行拓扑学分析。

1.5 GO和KEGG富集分析

基于DAVID 6.8平台进行交集基因的GO和KEGG通路富集分析，GO分析包括生物过程、分子功能和细胞组分（BP、MF、CC），全部选择P值＜0.05和FDR＜0.05的条目，得到潜在靶点参与的过程和作用通路，并根据P值排序选取靠前条目利用微生信平台[10]进行柱状图和气泡图可视化绘制。利用Cytoscape_v3.7.1的ClueGo和Cluepedia的插件对交集靶基因分析GO免疫系统过程，选择使用GO术语融合和限制P值≤0.05，设置Level最小为4最大为7、最小富集基因数为3、Kappa Score为0.4，并构建靶点-免疫过程网络图。

1.6 分子对接

取PPI网络中Degree（度）值排名前5作为受体蛋白，“活性成分-靶点-疾病”网络中活性成分节点度值排名靠前作为配体分子，登录PDB数据库[14]下载受体蛋白结构，利用PyMOL-2.3.4及AutoDockTools软件对蛋白和配体分子进行前处理，然后引用Vina进行分子对接预测配体小分子与蛋白结合能，选择最低结合能为最优构象。将受体配体对接文件经PyMOL处理后上传至Plip在线网站将验证结果进行可视化。

2 结果与分析

2.1 药物化学成分筛选

在TCMSP数据库中黄芪（HQ）检索到20种化合物，女贞子（NZZ）检索到13种化合物，两味药共检索到31 种化合物，包括白桦脂酸、华良姜素、常春藤皂苷元等，其中，槲皮素（A1）和山奈酚（A2）为两味药共有成分，同时查找文献发现黄芪中黄芪多糖、黄芪总皂苷以及女贞子中的齐墩果酸、熊果酸、红景天苷对免疫有调节作用[9,15-16]，故将以上成分补充共计36种成分建立黄芪-女贞子活性成分数据集，见表1。

表1 黄芪-女贞子活性成分信息Table 1 Information on active components of Astragalus and Ligustrum lucidum

2.2 活性成分靶点和疾病靶点

Swiss Tagert Prediction平台得到黄芪22个成分对应429个靶点，女贞子16个成分对应491个靶点，将黄芪、女贞子对应靶点合并删除重复值共得到有效靶点491个，在GeneCards数据库得到免疫缺陷病相关靶点共609个，与黄芪-女贞子预测靶点共有靶点81个包括TNF和ADA等，见图1和表2。

表2 黄芪-女贞子治疗IDD潜在靶点Table 2 Potential target of Astragalus and Ligustrum lucidum in the treatment of IDD

图1 黄芪-女贞子靶点和免疫缺陷病靶点韦恩图Fig.1 Wayne diagram of Astragalus-Ligustrum lucidum target and immunodeficiency disease target

2.3 “活性成分-潜在靶点-疾病”网络关系图

利用Cytoscape_v3.7.1软件绘制黄芪-女贞子治疗IDD的“活性成分-靶点-疾病”网络图（如图2）。网络图共涉及Nodes（节点）113个，Edges（边）428条。图中黄色方块代表黄芪活性成分，绿色方块代表女贞子活性成分，红色圆圈代表黄芪-女贞子共有成分，蓝色菱形代表药物干预疾病潜在靶点，紫色三角代表疾病，以degree值大小设置节点面积大小并按大小顺序进行排列筛选，排名前5的活性成分为NZZ11（木犀草素）、HQ16（异琥珀酰氨醇）、HQ10（美迪紫檀素）、HQ2（华良姜素）和A2（山奈酚），推测这些化合物可能是黄芪-女贞子治疗免疫缺陷病的主要活性成分。

图2 活性成分-潜在靶点-疾病网络图Fig.2 Active ingredients-potential targets-disease network diagram

从网络图中可以预测黄芪-女贞子36个成分中共有31个活性成分可作用于IDD，另外5种成分没有对应IDD靶点，其中，多数成分在已有研究中具有良好的免疫调节作用。如槲皮素除了可以增强环磷酰胺（CTX）的抗肿瘤作用，还可以提高免疫缺陷小鼠的外周血白细胞数目和巨噬细胞吞噬作用，促进T细胞、B细胞增殖来修复CTX所造成的免疫抑制[17-18]；山奈酚可以抑制小鼠淋巴细胞凋亡和活化的促炎因子，提高淋巴细胞活力，增加抗炎细胞因子和CD4+T水平（T淋巴细胞）来提高免疫力[19-20]；红景天苷可以促进小鼠T/B淋巴细胞增值率，从而提高免疫功能[21]，可以增加宿主RIG-I等天然免疫因子，提高宿主免疫力，同时可激活IRF-3基因，增加Ⅰ型干扰素的表达以发挥其抗病毒作用[22]；季宇彬等[23]研究发现肿瘤模型小鼠经黄芪多糖给药后可有助于其改善红细胞生理功能，增强红细胞CR1免疫活性、恢复免疫功能；圣草酚具有一定的抗氧化活性，可以增强NK细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞的杀伤活性发挥免疫调节作用[24]。IDD患者免疫系统受损，而这些活性物质可以增强B细胞、巨噬细胞等免疫细胞活性，推测黄芪-女贞子可通过激活免疫系统来干预IDD。异鼠李素可抑制金黄色葡萄球菌的α溶血素表达而产生一定的抑菌作用[25]；木犀草素可降低IL-6和TNF-α的表达来降低大肠埃希菌对呼吸道上皮细胞的感染，还可以影响一些参与自噬的信号分子以阻止癌症的发展，如促进Beclin-1的表达刺激细胞自噬来诱导肝癌细胞死亡[26-27]。IDD患者由于免疫屏障被破坏从而会引发恶性肿瘤、感染、自身免疫性疾病等复杂性疾病，如上述，不同有效活性成分具有不同药理作用，不仅能够调节免疫系统，还有抑制肿瘤、抗感染等作用，体现了中药干预疾病发展的整体性和综合性。

2.4 PPI网络构建

将STRING数据库中检索到的81个潜在靶点绘制成PPI网络图（如图3），该网络图包含73个节点和293条边，平均节点度值为8，有8个游离节点被隐藏。圆形节点大小表示度（degree）值，连线粗细和颜色深浅表示结合分数，度值越大表示该靶点越关键，根据PPI网络图分析可知，MAPK1、PIK3CA、STAT3、PIK3R1、SRC、AKT1、HRAS等靶点可能是黄芪-女贞子治疗IDD的关键靶点。

图3 黄芪-女贞子治疗IDD靶点蛋白相互作用网络图Fig.3 Target protein interaction network diagram of Astragalus-Ligustrum lucidum in the treatment of IDD

IDD的主要原因在于免疫系统遭到破坏从而导致系统疾病，因此，治疗IDD的重点在于帮助患者免疫重建，同时对于由免疫缺陷而引发的病症也进行对症治疗，如炎症、肿瘤等[2]。信号传导与转录激活因子-3（STAT3）是细胞存活和凋亡的关键调节因子，其可参与IL-6信号通道和诱导IL-17A、IL23受体、干扰素调节因子4等与Th-17细胞分化和增殖等相关基因的表达，STAT3的过度激活会影响T细胞发育造成免疫抑制，影响促炎介质的产生和抑制抗原呈现从而降低免疫细胞的抗肿瘤作用[28-29]，同时STAT3突变也会导致IDD的发生[30]，SRC家族激酶是非受体酪氨酸激酶，包含Lck、Fyn、Lyn等具有相似结构功能的成员，在免疫应答等生理过程有重要作用[31]，相关研究指出SRC家族激酶作为一个整体参与了人外周血T细胞抗原受体的下调，抑制Lck和Fyn的表达会损伤T细胞的激活和效应功能[32]。AKT1参与调节细胞功能，JIA等[33]发现AKT1参与抑制HIF-α依赖的糖酵解途径来调节髓源性抑制细胞的免疫抑制活性，对炎症损伤有保护作用。这些靶点主要涉及免疫细胞增殖分化和炎症反应的调控，推测黄芪-女贞子活性成分通过作用于这些靶点来减轻免疫抑制，促进免疫细胞发育，以及抗肿瘤从而综合干预IDD。

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析

DAVID 6.8平台中通过选择“Homo sapiens”限制P值＜0.05和FDR＜0.05得到81个交集基因涉及152条生物过程（Biological Process，BP），33条细胞组分（Cellular Component，CC），40条分子功能（Molecular Function，MF）。根据P值从小到大筛选BP、CC和MF排名前十绘制柱状图（如图4）。生物过程主要涉及药物反应，MAP激酶活性的正向调节和蛋白质磷酸化的正向调节等；细胞组分中主要影响细胞溶质、质膜、膜筏等；分子功能包括相同蛋白结合、不同蛋白结合、酶结合等。KEGG富集分析结果显示81个交集基因涉及91条KEGG通路，同样根据P值排序靠前的有Pathways in cancer、Prostate cancer、Glioma和Hepatitis B等通路 （如图5）。此外，将黄芪-女贞子干预免疫缺陷病81个潜在靶点基因导入ClueGo插件进行GO免疫系统过程分析，得到36个靶点共涉及到α-βT细胞活化等23条免疫系统过程，见图6。图中方形排列代表黄芪-女贞子干预IDD的相关靶点，外圈圆形排列代表免疫系统过程。

图4 黄芪-女贞子治疗IDD靶点GO富集分析柱状图Fig.4 Histogram of GO enrichment analysis of Astragalus and Ligustrum lucidum in the treatment of IDD

图5 黄芪-女贞子治疗IDD靶点KEGG通路富集分析气泡图Fig.5 Enrichment analysis of KEGG pathway in Astragalus and Ligustrum lucidum in the treatment of IDD

图6 潜在靶点GO免疫系统过程网络图Fig.6 Network diagram of potential targets GO immune system process

GO富集分析表明黄芪-女贞子干预IDD涉及到药物反应，MAP激酶活性的正向调节等生物过程，α-βT细胞活化、α-βT细胞分化等免疫系统过程，MAP激酶参与细胞生长、凋亡等一系列生理活动，如岩白菜素可以刺激巨噬细胞MAP激酶激活产生抗分岐杆菌效应分子从而给宿主提供免疫保护[34]；KEGG富集分析显示癌症途径、癌症中的蛋白质、乙肝、ErbB信号通路、HIF-1信号等通路可能是黄芪-女贞子干预免疫缺陷病的关键通路。有研究表明下调HIF-1信号通路可抑制肿瘤细胞增殖分化[35]，邓哲[36]发现薯蓣丸可通过HIF-1α信号通路增加肿瘤淋巴细胞CD8和CD4表达来杀死癌细胞。GO免疫系统过程分析结果显示黄芪-女贞子可通过参与α-βT细胞活化等过程调节免疫系统。本研究推测黄芪-女贞子参与多个生物过程和免疫过程，通过免疫和癌症相关通路综合作用于免疫缺陷病。

2.6 分子对接验证

为了验证黄芪-女贞子活性成分对其干预疾病潜在靶点作用的可能性，选取了MAPK1、PIK3CA、STAT3、PIK3C1和SRC作为受体（PPI网络图节点排名前五），在PDB数据库下载受体蛋白晶体文件：MAPK1（PDB ID:4zxt）、PIK3CA（PDB ID:6pys）、STAT3（PDB ID:6njs）、PIK3C1（PDB ID:5sxb）和SRC（PDB ID:2bdj），根据受体蛋白原配体确定对接口袋，和图2中度值排名前5的活性成分（NZZ11、HQ10、HQ16、HQ2、A2）在Vina软件中进行25次分子对接预测了靶点与成分之间的结合能（kcal/mol），见图7。

图7 主要活性成分与关键靶点分子对接结合能热图Fig.7 Heat map of docking binding energy between main active components and key target molecules

一般认为配体和受体结合能为负数就表示它们之间可以结合，结合能越小，其对接活性越大，发生作用的可能性越大，结合能小于-5 kcal/mol就代表两者之间有良好的结合性。对接结果显示A2（山奈酚）与SRC（2bdj）结合能最低，为-9.6 Kcal/mol，其次是NZZ11（木犀草素）与SRC（2bdj），结合能为-9.4 Kcal/mol，NZZ11（木犀草素）与PIK3CA（6pys），结合能为-8.9 Kcal/mol，将它们对接模式进行可视化（如图8）。A2（山奈酚）与SRC蛋白的LEU-273、VAL-281、LYS-295等氨基酸残基形成疏水作用，与LYS-295、MET-341和GLY-344形成氢键，见图8A；NZZ11（木犀草素）与SRC蛋白的VAL-281、ALA-293、LYS-295等氨基酸残基形成疏水作用，与LYS-295、GLU-310、MET-341、GLY-344和ASP-404形成氢键，见图8B；NZZ11（木犀草素）与PIK3CA蛋白的TRP-780、ILE-800、TYR-836等氨基酸残基形成疏水作用，与LYS-802、ASP-810、VAL-851和SER-854氨基酸残基形成氢键作用，见图8C。分子对接结果显示黄芪-女贞子的主要活性成分可以很好地与预测的主要潜在靶点结合在一起，验证了这些成分治疗IDD的可能性。

图8 结合活性较好的化合物与靶点蛋白分子对接示意图Fig.8 Schematic diagram of docking of compounds with good binding activity with target protein molecules

3 结论

本研究利用网络药理学相关理论初步研究黄芪-女贞子治疗IDD的活性成分、潜在靶点和作用途径，黄芪-女贞子中木犀草素和槲皮素等活性成分作用于MAPK1、PIK3CA、STAT3等关键靶点，通过免疫和癌症相关通路综合发挥辅助治疗免疫缺陷病的作用。分子对接预测黄芪-女贞子主要活性成分与IDD关键靶点的结合能较低，具有良好的结合活性。黄芪-女贞子不仅能调节免疫系统还有抗感染、抗肿瘤等作用，体现了其在干预免疫缺陷病时具有整体性、系统性特点，和中医在诊治疾病的标本兼顾的思想基本吻合。本文初步解释黄芪-女贞子在免疫缺陷病作用机制，为后续研究提供研究思路和方向，也为将黄芪-女贞子开发成调节免疫缺陷病患者身体机能的膳食补充剂提供参考。