香榧纯露的挥发性成分及抗氧化活性研究

孙君燕，孙 敏，宋诗清，王化田，冯 涛，姚凌云, ，俞文华

（1.上海应用技术大学香料香精化妆品学部，上海 201418；2.宁波华木来生物科技有限公司，浙江宁波 315131）

香榧（Torreya grandis）是红豆杉科榧树属植物，为我国特有的经济树种。香榧果实（香榧子）作为药食两用植物资源在我国具有悠久的应用历史，该果实外面裹有一层的肉质化假种皮，约占鲜重的50%～60%，长期被当作香榧子加工废弃物而没有得到有效利用，同时对环境造成不良影响[1-2]。近年来，随着对香榧假种皮化学成分和生物活性研究的深入，其开发价值逐渐被人们所认识，研究表明，香榧假种皮富含二萜、黄酮等多种活性次级代谢产物，可产生抗氧化、抑菌、抗病毒、抑止酪氨酸酶等生物活性，可作为芳香油和药用活性浸膏提取的天然优质原料[3-4]。

目前关于香榧假种皮的植物精油成分及生物活性已有一些报道。香榧精油主要含α-蒎烯、δ-杜松烯、D-柠檬烯等挥发性成分，具有抗氧化、酪氨酸酶抑制等活性[5-7]。纯露是提取精油过程中伴随产生的副产物，一般是指在精油蒸馏萃取过程中，分离出来的一种饱和的蒸馏原液，其中含有植物水溶活性成分，同时保留精油芳香，在食品、化妆品中常直接使用或作为溶剂应用[8-10]。香榧精油的提取过程中同样会产生大量的纯露，但香榧纯露的挥发性物质组成及生物活性的研究目前还尚未见报道。

本文通过LUMi Sizer稳定性分析仪对不同工艺处理香榧纯露的稳定性进行考察，利用气相色谱-质谱分析（GC-MS）技术对纯露的化学成分进行分析，并进一步通过体外抗氧化及秀丽隐杆线虫的氧化应激试验探究了香榧纯露的抗氧化活性，为香榧资源的深加工和香榧纯露的合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生型（N2）秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans） 上海南方模式生物科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS） 国药集团化学试剂有限公司；重铬酸钾、5-氟脱氧尿（5-fluoro-2‘-deoxy-β-uridine） Sigma公司；胆固醇、抗坏血酸（VC）、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁等试剂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉 生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物 英国OXOID公司。

UV2350型紫外可见分光光度计 上海尤尼科仪器有限公司；SPME萃取头 （100 μm CAR-PDMSDVB） 美国Supelco公司；GC-MS（7890A-5975C）安捷伦科技（中国）有限公司；LUMi Sizer稳定性分析仪 罗姆（江苏）仪器有限公司；电热恒温培养箱

上海新苗医疗器械制造有限公司；恒温水浴锅常州市人和仪器厂；FA1604型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 香榧纯露的提取 新鲜香榧假种皮在2020年10月采集于浙江会稽山一带，4 ℃冷库存放备用。称取50 kg香榧假种皮置于500 L不锈钢蒸馏塔，加入350 L去离子水蒸馏，蒸馏温度为90 ℃，冷凝温度0 ℃，蒸馏时间2.5 h。蒸馏收集的冷凝液通过离心（1500 r/min × 10 min）后进行油水分离，上层为香榧精油，下层为香榧纯露原液。香榧纯露原液经0.25 μm膜过滤处理获得过滤香榧纯露，两种纯露样品无菌灌装后均置于冰箱 （4±2）℃避光保存备用。

1.2.2 香榧纯露稳定性的测定 LUMi Sizer稳定性分析仪对纯露样品进行物理稳定性评估。仪器测定样品在离心作用红外透光率并绘制曲线，不稳定系数是指透光率积分对时间的曲线的斜率[11-12]。取香榧纯露样品注入到PC管样品皿底部，温度设定为25 ℃，离心转速为4000 r/min，透射率的特征线每60 s记录1次，共计1000次。通过不同时间的样品的透光率-位置图谱（指纹图）和不稳定系数柱状图，可定性评估香榧纯露的长期物理稳定性。

1.2.3 气相色谱-质谱（GC-MS）分析 气相色谱条件：GC-MS（7890A-5975C）升温程序：初始温度50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至120 ℃，保持3 min，再以8 ℃/min升温至280 ℃，保持5 min。进样口温度250 ℃，载气为N2，流速为1 mL/min，分流比15:1。质谱条件：接口温度 280℃，电子轰击（EI）源，电子能量70 eV，扫描质量范围33.00～55.00 amu，电子倍增器电压1000 V，溶剂延迟时间3 min。样品处理：先将SPME纤维萃取头插入气相色谱仪预处理30 min进行老化，温度为250 ℃；取5.0 mL香榧纯露置于顶空瓶中，加入2-辛醇10 μL（400 ppm），混合后置于45 ℃平衡20 min，然后将老化好的萃取头置入顶空瓶的上部顶空，于55 ℃吸附30 min，然后取出萃取头取出并直接插进气相色谱质谱联用仪（GC-MS）。利用NIST11和NIST11s标准质谱库对采集到的质谱图进行检索，采用色谱峰面积归一化法定量。

1.2.4 体外抗氧化实验

1.2.4.1 DPPH自由基清除实验 参考Pavlic等[13]的实验方法并稍作调整。对照溶液：取1 mL的2×10-4mol/L DPPH溶液加水使最终体积为4 mL，室温下避光30 min后，在517 nm处测量吸光值，记为A0；样品溶液：取1 mL的DPPH溶液分别与1 mL不同浓度的香榧纯露（20、40、60、80、100 mg/mL）混合，加水使最终体积为4 mL，测量不同浓度香榧纯露的吸光度，记为A。实验以相同质量浓度的VC作为阳性对照，每个样品重复3次，DPPH自由基清除率（%）=（A0-A）/A0×100。

1.2.4.2 ABTS自由基清除实验 参照Bai等[14]的方法并适当修改，将等体积（50 mL）7 mmol/L的ABTS与2.6 mmol/L过硫酸钾溶液混合，室温下避光12～16 h，得到ABTS+储备液，使用前用无水乙醇稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为 0.70±0.02，即得 ABTS+工作液。对照溶液：取一支10 mL试管，加入ABTS+工作液1.0 mL和无水乙醇3.0 mL于试管中至终体积4.0 mL，静置30 min，在734 nm波长处测吸光度，记为A0；样品溶液：取数支10 mL试管分别加入1 mL不同浓度的香榧纯露（20、40、60、80、100 mg/mL）溶液，加入无水乙醇2.0 mL，再加入ABTS+工作液使最终体积为4.0 mL，避光静置反应30 min，在734 nm波长处测吸光度，记为A。实验以相同质量浓度的VC作为阳性对照，每个样品重复3次，ABTS自由基清除率（%）= （A0-A）/A0×100。

1.2.5 秀丽隐杆线虫实验 本实验中所采用的线虫品系为野生型（N2）秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），培养线虫使用的培养基为表面涂布E. coliOP50的线虫标准培养基（NGM），在20 ℃下培养，相对湿度为40%。

1.2.5.1 线虫同期化处理 一条产卵期线虫1 h可以产卵8个左右。为得到同步生长的线虫，挑取进入产卵期的线虫若干条在一个平板中，把平板置于20 ℃恒温箱中孵育，孵育约2 h后，将平板中线虫挑出，平板中的卵孵化后即处于同一发育时期[15-16]。收集同期化线虫，进行氧化应激及线虫寿命试验。

1.2.5.2 重金属Cr6+应激实验 参考Yuen等[17]方法进行适当修改，取同期化之后正常生长至L4期（约3 d）的秀丽隐杆线虫幼虫，随机分组（空白对照组、样品组、VC对照组）置于3 cm的培养皿，每组培养皿中200条幼虫，培养48 h，分别加入1.7 mL的完全培养基，0.2 mL不同浓度的香榧纯露，0.1 mL的OP50（0.1 g/mL），空白对照组用无菌水代替纯露样品，阳性对照以0.05 mg/mL的VC溶液代替纯露样品，培养完成后，用移液枪将每组样品吸入到EP管中，用 M9缓冲液冲洗到EP管中，冲洗3遍，除去试样、大肠杆菌 OP50和已经死亡的成虫后，将线虫分配在96孔板的孔中，对照组及纯露样品处理组线虫均分3个孔，每个孔不少于30条虫，每孔加入8 μL的K2Cr2O7（10 mmol/L）和152 μL的M9缓冲液诱导线虫氧化应激反应，每4 h记录一次线虫存活的数量变化，考察纯露处理对线虫氧化应激的影响。

1.2.5.3 线虫寿命试验 将单条线虫挑入含有液体完全培养基的96孔板的每个孔中，完全培养基中添加2 mg/mL（湿重）OP50和400 μmol/L的5-氟去氧尿苷。试验设有空白组、样品组和VC对照组，纯露处理组设置不同的浓度梯度（香榧纯露10倍稀释液、50倍稀释液、100倍稀释液、500倍稀释液），每d记录死亡虫体的数目[18-19]。以无菌水代替纯露样品作为空白对照组，以0.05 mg/mL的VC溶液作为阳性对照，死亡标准是用金属丝触碰线虫，如虫体不动则判为死亡，每组实验重复三次。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 18.0软件进行方进行数据统计学分析，若无特别说明，实验数据为3次平行实验的平均值，试验结果以平均值±标准差以（±s）表示，并进行t检验或单向方差分析，P＜0.05为具有显著差异。在体外抗氧化和线虫试验中，所得数据利用Origin 9.0和GraphPad Prism 8软件绘制各个因素的动力学曲线。

2 结果与分析

2.1 香榧纯露稳定性测试

通过LUMi Sizer稳定性分析仪测定不稳定系数。不稳定系数反映了样品的整体不稳定性趋势情况，其值越接近1，产品分层越严重，越接近于0，表示产品分层现象不明显，稳定性越好[20]。从图1可知，两种样品的不稳定系数均接近0，具有较好的稳定性，但非过滤香榧纯露的不稳定性系数（0.192±0.009）大于过滤香榧纯露（0.007±0.003），过滤纯露的不稳定系数更趋近于0，说明纯露经过滤后稳定性大于非过滤纯露。香榧假种皮经水蒸气蒸馏提取后，馏出液含香榧精油（油相）和大量的香榧纯露（水相）两相，通过膜过滤工艺处理可更好地富集香味物质或提高纯露的稳定性。

图1 过滤与非过滤香榧纯露不稳定性指数Fig.1 Instability coefficient of filter-treated and untreated T.grandis hydrosols

不同工艺香榧纯露样品通过LUMi Sizer稳定性分析仪在25 ℃条件下测试30 s加速分析后的透光率指纹图谱见图2，其中横坐标是样品管的位置（mm），左端是指样品管的顶端，右端指的是样品管的底部，纵坐标是透光率数值（%）。红色是指初始透光率谱线，绿色是指结束时刻的透光率谱线，红色到绿色谱线的渐变是随着测试开始到结束的变化过程[21]。从图2可知，过滤纯露（图2B）与非过滤纯露（图2A）相比，初始透光率谱线与结束时刻的透光率谱线保持一致，总体具有更好稳定性。加速试验中，两种纯露样品均呈现顶端（105～109 mm）透光率升高，底部（128～130 mm）透光率降低，具有典型的沉降过程[22]。过滤香榧纯露（图2B）在样品管109～128 mm位置，初始透光率谱线与结束时刻的透光率谱线呈较为平整的直线，与非过滤纯露（图2A）相比具有较好的均一稳定性。根据LUMi Sizer稳定性分析仪测试结果（图1、图2），可知经过滤处理后的香榧纯露具有更好的稳定性。

图2 LUMi Sizer 稳定性分析仪评价非过滤（A）与过滤（B）香榧纯露长期物理稳定性结果Fig.2 Physical stability of untreated （A） and filter-treated （B）T. grandis hydrosols evaluated by LUMi Sizer

2.2 香榧纯露挥发性成分的GC-MS分析

实验通过HS-SPME结合GC-MS方法对香榧纯露的挥发性成分进行了系统分析，经GC-MS联用仪所配置的NIST-MS谱库进行检索，分析各组分的质谱数据，按峰面积归一化法测得各成分相对质量百分含量。在香榧纯露中，共鉴定出49种挥发性物质，主要成分包括醇类、萜类、酚类、醛类、烃类、酮类等。从表1可知，共鉴定出21种醇类化合物（41.82%），是纯露中主要的挥发性物质，包括3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-己烯-1-醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇、芳樟醇、环己醇、葑醇、4-萜品醇、β-松油醇、2-环己烯-1-醇、异龙脑、松油醇、2-茨醇、β-香茅醇、橙花醇、对甲基苯异丙醇、苯乙醇、紫苏醇、对异丙基苯甲醇、α-毕橙茄醇。其中，β-香茅醇（5.5%）、松油醇（16.45%）和4-萜品醇（11.14%）相对含量较大。β-香茅醇有优雅的玫瑰香气，具有抑制金黄色葡萄及伤寒杆菌活性，广泛应用于化妆品领域[23]。β-松油醇存在于多种精油中，如松油、橙花油等，有似海桐花的清香，甜的紫丁香、铃兰气息[24]。4-萜品醇是茶树叶挥发油的主要成分，具有良好的抗氧化活性[25]。

表1 香榧纯露成分的GC-MS 分析结果Table 1 GC-MS analysis of volatile compounds in T. grandis hydrosols

萜类化合物（5.27%）共有7种，包括单萜α-萜品烯、右旋萜二烯、萜品烯、罗勒烯、α-衣兰油烯、α-蒎烯，除单萜类化合物，还有其他萜类化合物如樟脑。α-萜品烯具有柑橘和柠檬似香气，常作为香料，制备人造柠檬和薄荷精油。右旋萜二烯别名为D-柠檬烯，有似鲜花的香气，具有良好的镇咳、祛痰、抑菌作用，已被广泛应用于食品、香料、日化、医药等行业[26]；萜品烯可以保护 SOD、GSH-Px 和 CAT 等抗氧化酶的活性，在一定程度上恢复由过氧化氢引发的细胞损伤，起到抗氧化作用[27]。罗勒烯有草香、花香并伴有橙花油气息，可用于多种日化香精配方中；萜品油烯、α-衣兰油烯、α-蒎烯用作香料的原料。其中α-蒎烯在一定作用水平下对大肠杆菌具有明显的抑制作用。樟脑具有兴奋、止痛、除湿、驱风等功效。

酚类化合物有5种，相对含量为1.58%，包括愈创木酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、甲基丁香酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、2,6-二叔丁基苯酚；其中愈创木酚有芳香气味，主要用作杀虫剂，用于香料和医药等领域；2-甲氧基-4-甲基苯酚可用于威士忌酒的增香剂，也可调配丁香、熏肉、香荚兰等食用香精和烟用香精；甲基丁香酚主要用于配制依兰型、康乃馨型、紫丁香型等香精[28]。

除了醇类、萜类、酚类化合物以外，还有烃类化合物有5种（1.49%），包括1,3-环己二烯、2,4-二甲基苯乙烯、十六烷和2,2-二甲基-3-亚甲基二环[2.2.1]庚烷、间异丙基甲苯；醛类化合物有3种，但相对含量较低（0.24%），包括3-羧基苯甲醛、壬醛、香桃木醛；其中壬醛具有玫瑰、柑橘等香气，有强的油脂气味，广泛用于配制人造玫瑰油和玫瑰型香精，工业生产中可用作食品、纺织品等的芳香剂或异味掩盖剂[29]。酮类化合物2种，包括环己酮（0.17%）和4-羟基-2-甲基苯乙酮（1.19%）；酯类化合物1种，邻苯二甲酸二丁酯，相对含量为1.51%，主要作为增塑剂和用于制备香料溶剂、织物润滑剂等。除此之外，还有酸类如乙酸，及其它类型的挥发性化合物如吡啶、3-甲氧基吡啶、油酸酰胺和硬脂酰胺等。

在水蒸气蒸馏提取植物精油过程中，挥发性成分经冷凝后分为油水两相，即精油和纯露，被蒸馏出来植物纯露中以醇类、酚类等水溶性成分为主[30]。香榧纯露的生物活性相关的报道较少，因此后续实验针对香榧纯露的生物活性开展了进一步的探索。

2.3 体外抗氧化试验结果

2.3.1 DPPH自由基清除试验结果 DPPH·氧化性强，当加入抗氧化物质后，DPPH·的产生会被抑制，颜色由紫变黄[31]。实验评价了香榧纯露的清除DPPH自由基的能力，以VC作为阳性对照，结果见图3，阳性对照VC在20～100 mg/mL浓度范围内，清除率达90%以上并趋于平衡，香榧纯露达到100 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达67.3%±1.2%，香榧纯露清除DPPH的IC50为73.10 mg/mL（VC为0.018 mg/mL）。以往研究表明，许多植物纯露都具有一定的抗氧化活性[32]，本研究中香榧纯露对DPPH自由基的最高清除率高于文献报道的玫瑰纯露[9]，表明其在功能性食品、化妆品等领域的应用潜力。

图3 香榧纯露对DPPH自由基的清除能力Fig.3 Effect of T. grandis hydrosols on DPPH free radical scavenging

2.3.2 ABTS自由基清除试验结果 香榧纯露ABTS自由基清除试验结果见图4，在20～100 mg/mL浓度范围内，香榧纯露对ABTS自由基清除能力随着香榧纯露浓度增加而增强，在100 mg/mL时清除率最高并趋于稳定，达到84.2%±3.7%（IC50=37.63 mg/mL）。VC（IC50=0.014 mg/mL）在20～100 mg/mL浓度范围内，对ABTS自由基清除率均为90%以上，清除率趋于平稳。香榧纯露对ABTS自由基的清除率虽然低于阳性对照VC，但清除率达到80%以上，表明期具有较好的体外抗氧化活性。

图4 香榧纯露对ABTS自由基的清除能力Fig.4 Effect of T. grandis hydrosols on ABTS radical scavenging

2.4 秀丽隐杆线虫实验结果

2.4.1 香榧纯露对线虫镉应激的影响 重金属应激反应是指秀丽隐杆线虫在一定浓度的重金属离子中的生存情况，可以反映秀丽隐杆线虫抵抗重金属诱导的氧化应激性[33-34]。在96孔板实验中，通过每孔加入8 μL的K2Cr2O7（10 mmol/L）考察不同样品对线虫存活的影响。从图5可知，以蒸馏水为样品的空白对照存活时间最短（60 h），添加阳性对照VC可极显著提高线虫存活时间至64 h（P＜0.01），不同稀释浓度（10～100倍稀释）的香榧纯露对线虫存活时间的延长同样显著（P＜0.05），当稀释达500倍时对线虫存活时间无明显影响（图5D）。目前已有较多文献报道，植物挥发性成分可以调节线虫自身的氧化应激性能并延长线虫的寿命。如杜松子 （Juniperus communis）精油在较低剂量（10 ppm）显示出抵抗各种氧化和热应力的潜力，并且可使线虫的寿命延长18.54%[35]。本研究试验结果表明，香榧纯露在一定浓度内具有显著提高线虫抵抗重金属诱导的应激能力（图5A～C），并且与浓度存在相关性，随着纯露浓度降低（稀释倍数增大），其抵抗镉应激能力减弱（图5D），显示香榧纯露在一定浓度范围具有对线虫的抗氧化应激和延长寿命方面的活性。

图5 香榧纯露对线虫应镉激抵抗能力的影响Fig.5 Effect of T. grandis hydrosols on stress resistance of C.elegans under stimulation of Cr6+

2.4.2 香榧纯露对线虫寿命的影响 将同步到L4期的线虫转移至96孔板，培养基中添加5-氟去氧尿苷（400 μmol/L）抑制线虫繁殖，每天观察并记录线虫的存活数量，直至所有线虫死亡为止，不同浓度香榧纯露对线虫寿命的影响如图6所示。空白组线虫寿命最长为24 d，添加VC（0.05 mg/mL）和香榧纯露可使线虫的最长寿命延长，添加VC可使线虫最长寿命延长至30 d，稀释10、50、100、500倍的香榧纯露可使线虫最长寿命延长至32、28、28、26 d，表2可知，与空白组相比，添加VC的线虫平均寿命提高29.5%，添加稀释10、50、100、500倍的香榧纯露，线虫平均寿命依次提高约为30.7%、21.8%、14.3%、7.8%。

图6 不同稀释倍数香榧纯露对线虫寿命的影响Fig.6 Effect of T. grandis hydrosols on life span of C. elegans

表2 香榧纯露对线虫寿命的影响Table 2 Effect of T. grandis hydrosols on life span of C.elegans

从表2可知，同空白组相比，添加VC及高浓度香榧纯露组可使线虫平均寿命和中位生存时间显著增加。线虫平均寿命及中位生存时间的增加与香榧纯露的浓度呈正相关，试验的最高浓度组（香榧纯露原液稀释10倍）的平均寿命、中位生存时间及最长寿命时间相比空白组均显著增加（P＜0.01），且优于阳性对照VC（0.05 mg/L），表明香榧纯露在一定浓度范围具有延缓衰老、延长线虫寿命的作用。

3 讨论与结论

采用LUMi Sizer稳定性分析仪对非过滤和过滤工艺下香榧纯露的稳定性进行了比较，通过不稳定系数分析及加速试验透光率指纹图谱对比，表明过滤香榧纯露具有较低的不稳定系数和更好的稳定性。在此基础之上，对香榧纯露的成分与抗氧化活性进行了研究。香榧纯露通过GC-MS共鉴定出49种化合物，其中醇类化合物占较大比例共21种（41.82%），如松油醇（16.45%）、4-萜品醇（11.14%），7种萜类化合物（5.27%），还有酚类（5种）、醛类（3种）及其他类型挥发性化合物等。

体外DPPH、ABTS自由基清除能力的测定结果表明，香榧纯露具有较好的抗氧化作用，且清除自由基能力在试验中与香榧纯露的质量浓度呈正相关。秀丽隐杆线虫抗氧化应激试验结果表明，香榧纯露可以提高线虫的抗氧化应激能力且与浓度呈正相关，在试验考察的最高浓度（香榧纯露原液稀释10倍）时其体内抗氧化应激性能与阳性对照药物VC（0.05 mg/L）接近。秀丽隐杆线虫由于其较短的寿命周期、高度保守的基因和拥有与人相似的衰老通路，常被用作衰老研究的模式生物[36-37]。本试验中线虫寿命结果表明，香榧纯露在一定浓度范围可显著提高线虫平均寿命及中位生存时间，而对于其延缓衰老的成分及作用机制还需要后续的进一步研究。

香榧是我国特有的植物资源，本文对香榧假种皮提取精油过程的副产物香榧纯露进行了成分鉴定和体内外抗氧化活性研究，相关结果表明香榧纯露具有应用在抗氧化、抗衰老功能性食品、化妆品上的潜能。本研究结果为香榧资源的综合利用和开发提供了科学依据与理论参考，但寿命延长机制还有待于在今后工作中继续深入探究。