南方红豆杉根际促生细菌蜡状芽孢杆菌CLY07 的接种效应

冯 丹 曹永清 刘 艳 任嘉红

（1. 山西师范大学生命科学学院，山西 临汾 041000；2. 长治学院生物科学与技术系，山西 长治 046011）

南方红豆杉（Taxus chinensisvar.mairei）为红豆杉科红豆杉属常绿大乔木，是我国Ⅰ级重点保护植物，素有“活化石”之称[1]，是我国特有的集观赏、药用和材用于一体的珍稀树种。长期以来，人们对南方红豆杉的乱砍乱伐以及对紫杉醇过度开发利用，加之红豆杉自然繁殖率低、生长速度慢等多原因导致野生红豆杉属植物现存数量越来越少[2]。

植物根际促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria, PGPR）是指能够促进植物生长、增加植物产量，并能防止病害的一类植物根际细菌。研究发现，PGPR 含有固氮、解磷、产IAA等多种促生长特性[3]，其中，ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶是PGPR 的一个重要的促生指标，也是许多PGPR 的共同特征[4]，可通过将ACC 降解为α-酮丁酸和氨，来降低应激诱导产生的乙烯的内部浓度，提高植物抗逆性；同时，α-酮丁酸和氨可作为C、N 源利用，促进植物生长[5-6]。

笔者课题组前期从南方红豆杉根际土壤中分离筛选出一株具较强产ACC 脱氨酶能力的CLY07 菌株，本研究通过形态学、生理生化、基于16S rDNA 序列的系统发育分析等方法对该菌株进行鉴定，以确定其分类地位，对其产ACC 脱氨酶能力进行定量测定，并克隆其ACC 脱氨酶acds基因；同时还对其解磷、产IAA、产嗜铁素能力等促生长特性进行测定。此外，利用GFP 标记技术明确该菌株在南方红豆杉根际的定殖情况，并将菌株回接于红豆杉幼苗根际，通过测定生长参数指标评估CLY07 对南方红豆杉的促生长效应。本研究为开发南方红豆杉细菌肥料提供了优良的菌株资源，对南方红豆杉的人工栽培及珍贵野生资源的保护具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

菌株CLY07，由本实验室从南方红豆杉根际土壤中分离得到，现保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2010157。

1.1.2 培养基

TSB、DF 和ADF 参照文献[7]，LB 和NBRIP参照文献[8]，CAS 参照文献[9]。

1.2 ACC 脱氨酶活性的测定

ACC 脱氨酶酶活性通过每毫克蛋白质在每小时产生的α-酮丁酸盐的量来测定[10]。具体方法参照文献[11]。蛋白质含量使用Bradford 蛋白定量试剂盒进行定量测定，以牛血清蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线。

1.3 产ACC 脱氨酶细菌的促生能力测定

1.3.1 产IAA 能力测定

将甘油管保藏的供试菌株按1%的比例接种于液体LB 中于30 ℃，180 r/min 振荡培养12 h 进行活化，吸取活化后的菌悬液500 μL 分别接种于含有L-色氨酸（终浓度为100 mg/L）与不含色氨酸的50 mL 的LB 液体培养基中培养7 d，进行显色反应[12]，颜色越红则表示菌株产IAA 能力越强。根据显色后的颜色变化，初步测定供试菌株产IAA 能力。

培养液离心之后取上清液与S2 显色剂等体积混合，室温避光放置30 min 后，于530 nm 处测OD 值。同时配制浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL 的IAA 标准溶液，绘制标准曲线，根据IAA 的标准曲线估计菌株产生的IAA 含量。具体方法参照文献[12]。

1.3.2 解磷能力测定

将甘油管保存的供试菌株在LB 固体培养基上划线，于30 ℃倒置培养18 h。待有单菌落长出后，挑取单菌落至50 mL LB 液体培养基中扩大培养24 h。将活化好的菌株参照白变霞等[13]的方法测CLY07 的解有机磷能力。

将活化好的菌株接种于NBRIP 固体培养基中，做3 个平行对照，观察菌落周围透明圈的大小。将菌液以1%的接种量接种于NBRIP 液体培养基中，30 ℃，180 r/min 振荡培养5 d，发酵液以4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，采用钼锑抗比色法测定上清液有效磷含量。参照于淼等[14]方法计算CLY07 的解无机磷能力。

1.3.3 产嗜铁素能力测定

根据通用CAS 琼脂平板法测定细菌的铁载体活性。若菌落周围产生黄色或橙色透明圈，则说明该菌株具有分泌铁载体能力；并定量测定CLY07 的产嗜铁素能力[15]。其中，产嗜铁素能力=嗜铁素单位数/OD600。

1.4 产ACC 脱氨酶细菌耐盐能力检测

将CLY07 接种于含NaCl 浓度分别为1%、2%、4%、6%、8% 的LB 液体培养基中，28 ℃，200 r/min，振荡培养18 h 后测定OD600，以盐浓度为横坐标，OD600为纵坐标，绘制供试菌株耐盐能力曲线。

1.5 产ACC 脱氨酶细菌的鉴定

1.5.1 形态和生理生化鉴定

将活化后的菌株接种在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于30 ℃倒置培养24 h，观察其菌落的形态特征，参照《微生物学实验》[16]对菌株进行革兰氏染色、芽孢、鞭毛、伴孢晶体染色。参照《常见细菌鉴定手册》[17]进行生理生化鉴定。

1.5.2 CLY07 菌株16S rDNA 序列的测定与系统发育分析

采用CTAB 法提取菌株基因组DNA，用16S rDNA 通用引物（16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S-R：5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′）对基因组DNA 进行扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验合格并纯化后送至北京华大基因进行测序。将得到的16S rDNA 序列在NCBI 上通过BLAST 搜索分析并根据其最临近菌株进行鉴定后，向GeneBank 提交序列，同时用MEGA 6.0 构建该菌株系统发育树。

1.6 产ACC 脱氨酶细菌acds 基因序列的克隆与分析

通过CTAB法提取细菌总DNA，采用Blaha等[18]的acds基因引物（ACDS-F1936：5′-GHGAM GACTGCAAYWSYGGC-3′；ACDS-F1938：5′-A TCATVCCVTGCATBGAYTT-3′）对基因组DNA进行PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证成功后，切取大小为1 000 bp 左右的条带进行回收，回收产物与pMD19-T 载体连接，转入大肠杆菌JM109 感受态细胞中，经蓝白斑筛选与菌液PCR 检验后，挑选出阳性克隆送至北京华大基因进行测序，将得到的DNA 序列在NCBI 进行分析，并将其编码蛋白的氨基酸序列在NCBI 比对，采用Mega6.0 绘制系统发育树。

1.7 CLY07 在南方红豆杉幼苗根际的定殖测定

采用修改后反复冻融的方法[19]将带有绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒pGFP4412 转入到CLY07的感受态中，用含新霉素和氨苄霉素的LB 固体培养基筛选阳性克隆子，并用琼脂糖凝胶电泳和荧光显微镜进行检测，将绿色荧光较强且能稳定遗传的阳性克隆子接种于南方红豆杉幼苗根际，每5 d 对根际土壤中的标记菌株进行回收，检测CLY07 在南方红豆杉幼苗根际的定殖动态与存活规律，并通过荧光显微镜观察菌株在根表面的定殖情况。

1.8 CLY07 盆栽苗实验

将甘油管保存的菌株划线活化后，挑取单菌落接种于NB 培养基中，在30 ℃，180 r/min 下振荡培养48 h。发酵液离心（4 ℃，6 000 r/min）去上清后用无菌生理盐水将菌体洗涤2～3 次，制成菌悬液。以每株5 mL 接种量接种于南方红豆杉1 年生幼苗根际，以等量无菌水为空白对照。置于温室统一管理，2 d 浇1 次水。接种1 年后，采用对氨基苯磺酸氨比色法测定硝酸还原酶、 H2SO4-H2O2消煮及凯氏定氮法测定含氮量、分光光度法测定硝基氮、Folin-酚试剂法测定可溶性蛋白以及钼锑抗比色法测定含磷量等营养代谢指标；此外，利用分光光度法对叶绿素含量、氯化三苯基四氮唑（TTC）法对根系活力，烘干法对生物量进行测定，同时，利用卷尺测量盆栽苗的苗高和地径等。具体方法参照《植物生理学实验指导》[20]。

2 结果与分析

2.1 CLY07 菌株的促生能力

对从南方红豆杉根际土壤中分离筛选出的产ACC 脱氨酶菌株CLY07 的发酵液进行α-酮丁酸盐含量测定结果显示，CLY07 菌株的产ACC 脱氨酶酶活为0.20 mmol/(mg·h)，定性检测结果显示产ACC 脱氨酶能力很强。

对CLY07 菌株的产IAA、溶无机磷以及产嗜铁素能力进行定性检测，结果表明，菌株CLY07具有产IAA、溶磷和产嗜铁素能力（图1～3），其中产IAA 与解有机磷能力较强。通过定量测定，CLY07 菌株产IAA 能力为8.35 mg/L，溶有机磷能力为26.65 mg/L，溶无机磷能力为635.21 mg/L，产嗜铁素能力为23.93%。

图1 CLY07 菌株产IAA 能力Fig. 1 IAA production of strain CLY07

图2 CLY07 菌株解无机磷能力Fig. 2 Phosphate-solubilizing effects of strain CLY07

图3 CLY07 菌株CAS 平板检测Fig. 3 CAS detecting plate cultivation result of strain CLY07

2.2 CLY07 的耐盐能力

通过用含有不同浓度NaCl 的LB 液体培养基对CLY07 进行振荡培养，发现该菌株具有一定的耐盐性。随着盐浓度增加，菌液OD 值呈现先不变后下降的趋势。当NaCl 浓度超过2%时，菌液OD 值开始下降，当盐浓度达到4% 时，菌液OD 值降至最低，因此推测该菌耐受的最高盐浓度为2%（约342 mmol/L 氯化钠）（图4）。按照Vreeland[21]对耐盐菌的分类方法可推断，CLY07为轻度耐盐菌株，有望为南方红豆杉减轻盐胁迫。

图4 CLY07 的耐盐能力Fig. 4 Salt tolerance of CLY07

2.3 CLY07 菌株的鉴定

CLY07 为革兰氏阳性杆菌，菌体杆状，大小约0.95 μm×1.45 μm～2.50 μm×4.10 μm；中生芽孢，周生鞭毛，不产伴孢晶体；在牛肉膏蛋白胨培养基上，菌落呈乳白色，无光泽，圆形，边缘整齐，菌落大且干燥；好氧，氧化酶反应、3% KOH试验、明胶水解试验和柠檬酸盐生长试验均为阴性；接触酶实验、硝酸还原试验、甲基红试验、VP 试验、吲哚实验以及淀粉水解实验均为阳性。

将CLY07 菌株的16S rDNA 序列在NCBI 数据库中进行比对分析，并运用MEGA6 构建系统发育树（图5）。由图5 可以看出，CLY07 菌株与芽孢杆菌属（Bacillus）同源性较高，其中与蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）最为相似，相似度达到100%。结合CLY07 的形态学鉴定以及生理生化分析，将该菌株鉴定为蜡状芽孢杆菌；同时，向GeneBank 提交序列获得登录号MT775468。

图5 基于菌株CLY07 16S rDNA 及其同源序列构建的系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree of the strain CLY07 based on 16S rDNA sequence

2.4 acds 基因序列的克隆与分析

以CLY07 菌株的基因组DNA 为模板，采用acds基因引物扩增出约为1 000 bp 条带，经测序知该基因序列大小为996 bp。在NCBI 上进行序列比对，并运用MEGA 6.0 构建CLY07 的acds基因编码的氨基酸的系统发育树，发现其与菌株Bacillus albus（WP 166 688 352.1）处于同一遗传分支，且同源性达到88%，由此确定，CLY07 菌株acds基因序列与菌株Bacillus albus的acds基因序列在进化上最为相近（图6）。这表明该菌株具有与合成ACC 脱氨酶相关的acds基因，在分子水平揭示该菌株具有产ACC 脱氨酶能力，与前期产ACC 脱氨酶的测定结果一致。

图6 CLY07 菌株的acds 基因编码氨基酸的系统发育树Fig. 6 Phylogenetic tree of amino acids encoded by the acds gene of strain CLY07

2.5 CLY07 在南方红豆杉根际的定殖动态

通过GFP基因的转化获得阳性克隆菌株，将筛选出的绿色荧光强且能稳定遗传的阳性克隆子接种于南方红豆杉幼苗根际，通过对目的菌株的回收检测，发现回收菌株数量呈现先上升后下降的趋势。在接种5 d 时，土壤中的菌数达到最大值（1.0×108cfu/g 干土）；当接种时间超过30 d时，菌数稳定在1.6×107cfu/g 干土（图7）。推断其主要原因是菌种在根表面定殖后大量繁殖，随着营养物质的减少，竞争逐渐增强，导致数量菌体减少最后处于稳定。这说明CLY07 菌株具有在南方红豆杉根际持久定殖的能力。利用荧光显微镜对红豆杉根表面进行观察，根表面含有大量的GFP 标记的菌株（图8），进一步表明菌株CLY07能在南方红豆杉根表面长期稳定定殖，从而发挥促生效应。

图7 GFP 标记CLY07 菌株在南方红豆杉根际的数量变化动态Fig. 7 Population fluctuation of strain CLY07 tagged with GFP in T. chinensis var. mairei rhizosphere

图8 GFP 标记CLY07 菌株在南方红豆杉根表面的定殖Fig. 8 Strain CLY07 tagged with GFP in the root surface of T. chinensis var. mairei

2.6 CLY07 对南方红豆杉的接种效果

在温室条件下，CLY07 对南方红豆杉有明显的促生长作用。接种1 年后苗高、叶绿素、生物量、地径以及根活力等指标显著高于对照组（表1），增长率分别为36.90%、73.68%、16.67%、4.11%和4.07%。接种CLY07 对南方红豆杉的营养代谢同样有较好的促进作用（表2），与CK相比，南方红豆杉中可溶性蛋白、硝基氮、含氮量与磷含量均增长了224.30%、100.19%、23.03%和25.37%，而硝酸还原酶活性降低了9.67%，这表明CLY07 可通过改善南方红豆杉对N、P 等养分的吸收能力以促进植物的生长。

表1 CLY07 对南方红豆杉的接种效应Table 1 Inoculation effect of CLY07 on T. chinensis var. mairei

表2 CLY07 对南方红豆杉养分代谢的影响Table 2 Effect of CLY07 on nutrient metabolism of T. chinensis var. mairei

3 结论与讨论

由于市场对紫杉醇的需求日益增加，野生南方红豆杉已经不足以维持市场的需求，现阶段主要通过人工种植该属植物来满足所需的紫杉醇。由于其生长速度慢、对环境的要求较为严苛，传统人工栽培成活率低，导致无法大面积种植。虽然化学肥料能有效地促进南方红豆杉的生长[22]，但对环境的危害也在日益严重。因此，寻得一种既能高效促进南方红豆杉生长，又不污染环境的肥料显得尤为重要。

大量研究表明产ACC 脱氨酶菌株能够有效的促进植物的生长发育。植物在逆境胁迫下，会合成高浓度乙烯，进而抑制植物的生长。产ACC 脱氨酶细菌能够利用ACC 脱氨酶分解植物中乙烯的直接前体ACC 来降低乙烯含量，从而抑制植物中乙烯的积累，缓减乙烯对植物的抑制作用，提高植物对逆境的耐受能力[23]。Sarkar 等[10]将Enterobactersp.接种于水稻种子与幼苗后，发现株高、叶绿素含量较对照相比都显著提高；费诗萱等[5]在红枣（Zizyphus jujuba）幼苗根际接种Pseudomonas putida，幼苗在株高、生物量以及植株中的N、P 含量都比对照有显著性差异。本课题组将含有GFP 标记的蜡状芽孢杆菌CLY07 接种至南方红豆杉根际土壤中，并对目标菌株进行回收及荧光显微镜观察，菌株数量最后稳定至1.6×105cfu/g干土，可见CLY07 能够在红豆杉根际土壤中稳定持久定殖；将CLY07 接种于南方红豆杉的幼苗中，幼苗的生长状况明显优于对照组，尤其是苗高增长率为36.90%，叶绿素含量提高了73.68%。通过测定南方红豆杉营养代谢能力，发现CLY07能够促进红豆杉对土壤中N、P 等元素的吸收，极好地促进了南方红豆杉的生长。

芽孢杆菌作为PGPR 中极有应用前景的一大类群，它们通过固氮、溶磷、产IAA 以及铁载体等多途径增加环境中营养元素，以促进植物生长；通过分泌次生代谢产物或诱导系统抗性（ISR）来防治植物病害[24]。Maxton[25]分离得到的Bacillus cereus对辣椒（Capsicum annuum）有明显的促生作用；李文英等[26]于香蕉（Musa nana）根际土壤中筛选出的Bacillusspp.能显著促进幼苗的生长，并能有效防治香蕉枯萎病发生。本实验前期从南方红豆杉根际土壤中筛选出的CLY07 菌株具有高效的产ACC 脱氨酶能力，同时具有溶磷、产IAA、产嗜铁素、耐盐等能力。此外，通过PCR 技术克隆出了ACC 脱氨酶相关acds基因，从基因水平进一步证实了该菌株具有产ACC 脱氨酶能力。由此推测，CLY07 具有较好的应用前景，为开发南方红豆杉专用微生物肥料奠定一定的理论基础，对保护我国南方红豆杉珍贵野生资源具有重要意义。