血浆miR-101水平与COPD急性加重期并呼吸衰竭患者气道反应性的关系探讨

杜发强

河南省周口市人民医院 466000

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸科常见疾病，在40岁以上人群中发病率约为8.2%，COPD易反复发作，根据病情可分为稳定期和急性加重期[1]。COPD急性加重期并呼吸衰竭患者气管、支气管处于一种异常敏感的状态，对刺激表现出过强、过早的收缩反应，易引发气道高反应性[2]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)为单链、内源性、非编码RNA，由21～25个核苷酸组成，参与细胞增殖、分化等多个生物学过程，具有十分重要的作用[3-4]。有相关研究表明[5]，微小核糖核酸-101(micro ribonucleic acid-101，miR-101)可抑制纤维细胞的增殖、活化，进而减轻肺纤维化。为了解血浆miR-101水平与COPD急性加重期并呼吸衰竭患者气道反应性的关系，本研究通过分组研究分析，探讨血浆miR-101水平与COPD急性加重期并呼吸衰竭患者气道反应性的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年2月—2019年3月本院收治的186例COPD急性加重期并呼吸衰竭患者进行研究。186例患者中男113例，女73例，年龄45～78岁，平均年龄(58.63±8.27)岁，COPD病程3～10年，平均COPD病程(5.83±1.12)年，病程≤5年者98例，病程>5年者88例；呼吸衰竭分型：Ⅰ型56例，Ⅱ型130例；吸烟87例；气道炎症97例；肺功能损伤程度[6]：轻度44例，中度57例，重度52例，极重度33例。纳入标准：符合COPD急性加重期诊断标准[7]，且为呼吸衰竭者；对本研究知情者。排除标准：严重心、肝、肾功能不全者；严重排痰障碍者；近期接受口腔、面部或颈部手术者；精神疾病或有认知障碍者。

1.2 方法

1.2.1 血样采集。使用抗凝采血管，采集所有研究对象外周静脉血5ml，3 000r/min，离心5min，分离血浆，-80℃超低温保存待测。

1.2.2 血浆miR-101表达水平测定方法。利用miRNA提取试剂盒(杭州诺扬生物技术有限公司)提取血浆miRNA，并检测miRNA的质量和浓度，将miRNAs反转录为cDNA，miR-101及内参U6序列：miR-101上游引物为：5’-TACAGTACTGTTGATAACTGAA-3’，下游引物为5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6上游引物为：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’；下游引物为5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。反应体系为20μl：10μl 2×SYBR Mix，10×cDNA模板1μl，上下游引物各1μl，H2O 8μl，每样品3个重复，反应程序：95℃预变性3min，95℃ 10s、60℃ 30s，72℃ 2min，35个循环，72℃延伸10min，在PCR仪上进行反应，以U6作为内参按照2-ΔΔCq法分析基因相对定量表达。

1.2.3 测定气道高反应性方法。采用脉冲振荡肺功能仪，连续测定10个自主呼吸波第1秒用力呼气容积(FEV1)、共振频率(Fres)、呼吸总阻抗(Z5)、总气道阻力(R5)、中心气道阻力(R20)等，以Z5增加39.90%、R5增加43.50%判断存在气道高反应性[8]。

1.2.4 影响气道高反应发生因素的分析方法。归纳可能影响气道高反应性的相关因素：主要包括性别、年龄、身体质量指数(BMI)、呼吸衰竭分型、吸烟、COPD病程、遗传因素、呼吸道感染、气道炎症、肺功能损伤程度、血浆miR-101水平，将其作为自变量(X)，对其进行赋值，结果见表1；将气道反应性作为因变量(Y)，气道高发性记为1，气道正常记为0，分析影响因素。

表1 影响气道高反应性发生的自变量赋值结果

1.2.5 采用受试者工作特征曲线(ROC)，以脉冲振荡肺功能测定结果为金标准，分析血浆miR-101对气道高反应性的评估价值。

1.3 观察指标 气道高反应性发生情况及气道高反应性组与气道正常组血浆miR-101表达水平对比。对比气道高反应性组和气道正常组自变量构成比并进行Logistic回归分析。血浆miR-101表达水平对是否发生气道高反应性的评估效能。

1.4 统计学方法 用SPSS23.0软件分析所得数据，以n(%)描述计数资料，以χ2检验两样本间差异，以Logistic回归分析探讨影响因素，以秩和检验2组间等级分布的数据差异，采用ROC曲线分析血浆miR-101表达水平对气道高反应性的评估效能。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 气道高反应性发生情况及气道高反应性组与气道正常组血浆miR-101表达水平对比 本研究186例COPD急性加重期并呼吸衰竭患者中有68例发生气道高性，发生率为36.56%(68/186)；气道高反应性组血浆miR-101水平明显高于气道正常组(P<0.05)，见表2。

表2 气道高反应性组与气道正常组血浆miR-101表达水平对比

2.2 血浆miR-101表达水平与气道高反应性的关系 气道高反应性组吸烟、COPD病程>5年、遗传因素、呼吸道感染、气道炎症、血浆miR-101水平>1.0构成比均显著高于气道正常组(P<0.05)；2组患者肺功能损伤程度分布差异显著(P<0.05)，气道高反应性组肺功能重度损伤、肺功能极重度损伤构成比均显著高于气道正常组(P<0.05)；并经Logistic回归分析可知，吸烟、COPD病程>5年、遗传、呼吸道感染、气道炎症、肺功能重度损伤、肺功能极重度损伤、血浆miR-101>1.0均是影响气道高反应性发生的独立危险因素，见表3、表4。

表3 气道高反应性组和气道正常组自变量构成比对比[n(%)]

表4 Logistic回归分析

2.3 血浆miR-101对气道高反应性的评估价值 ROC分析显示，血浆miR-101评估发生气道高反应性的最佳截断点为0.81，灵敏度为86.76%，特异度为73.73%，准确度为78.49%，曲线下面积(AUC)值为0.851。见图1、表5。

表5 血浆miR-101对气道高反应性的ROC分析

3 讨论

气道高反应性的发生与气道炎症、吸烟、气道平滑肌及气道表面渗透压的改变等多种因素有关，会导致气道缩窄、气道阻力增加，进而引发胸闷、咳嗽、喘息等症状，COPD急性加重期并呼吸衰竭患者气流受限严重，易引发气道高反应性[9]。一些地区的医院无法通过脉冲振荡肺功能仪进行气道高反应性检测，此外缺乏方便、灵敏的早期检测方法，多数患者确诊较晚，严重影响了患者的治疗、康复。有研究显示miRNA的异常表达与肺组织纤维化、炎症因子抑制等相关[10-11]，不同的miRNA在不同组织、细胞中发挥的作用不同，同一miRNA在不同疾病中的表达也不同。故而，探究miR-101表达水平与COPD急性加重期并呼吸衰竭患者气道反应性的关系具有重要意义。

图1 miR-101 ROC图

miRNA由21～25个核苷酸组成，其异常表达与器官纤维化、肿瘤细胞的侵袭、迁移等有关[12]。随着学者们对分子生物的深入探讨，越来越多的miRNA被发现并进行了研究[13-15]，miR-101家族高度保守，在小鼠、猪及人类中均有发现，人类的miR-101a序列与小鼠完全相同，而miR-101b则就有1个核苷酸不同[16-18]。miR-101与肝脏、肺等器官纤维化、动脉粥样化等多种疾病有关，能够对多种基因的表达进行调节[19-20]，另外，miR-101还直接参与调节转化生长因子-β(TGF-β)、囊性纤维跨膜调节因子(CFTR)等表达[21-22]。本研究中，有68例患者发生气道高反应性，发生率为36.56%，气道高反应性组血浆miR-101表达水平明显高于气道正常组，提示气道高反应性患者血浆miR-101表达水平上调，呈高表达，发挥促使气道反应性发生的作用，参与气道高反应性的发生和发展。

本研究通过对血浆miR-101表达水平与气道高反应性的关系进行探讨，发现气道高反应性的发生与吸烟、COPD病程>5年、遗传、呼吸道感染、气道炎症、肺功能重度损伤、肺功能极重度损伤、血浆miR-101>1.0紧密相关，病程的增长、炎症的加重、肺功能损伤的加重及血浆miR-101的高表达等，均会影响气道高反应性的发生、发展，提示上述指标均是影响COPD急性加重期并呼吸衰竭患者发生气道高反应性的独立危险，需加强防控，逐一控制各项危险因素的不良影响，以达到降低COPD急性加重期并呼吸衰竭患者发生气道高反应性的目的，减轻气道高反应性对患者造成的危害。本研究还发现，ROC曲线分析显示在血浆miR-101表达水平最佳截断点为0.81，灵敏度为86.76%，特异度为73.73%，准确度为78.49%，AUC为0.851，说明血浆miR-101表达水平在评估气道高反应性方面具有较高的临床价值，可作为早期检测指标。

综上所述，血浆miR-101在气道高反应性患者中呈高表达，且气道高反应性的发生与患者吸烟、COPD病程>5年、遗传、呼吸道感染、气道炎症、肺功能重度损伤、肺功能极重度损伤、血浆miR-101>1.0有关，血浆miR-101表达水平可作为COPD急性加重期并呼吸衰竭患者气道高反应性的评估指标，其最佳截断点为0.81。本研究仅对血浆miR-101在气道反应性中的临床意义进行初步探究，其具体的作用机制还需进一步深入研究。