NO信号分子对精子功能的影响

周佳勃，吴 桐，林敬轶，刘 雪，边小琪，李丹彤，岳顺利

(东北农业大学 生命科学学院 黑龙江省动物细胞与遗传工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种重要的气体信号分子能够参与体内多种生理生化反应。自1986年NO被正式发现以来，它是目前研究最多的体内信号分子和效应分子[1]。近年来，国内外研究发现NO在血管、中枢神经系统、外周神经系统以及免疫系统等方面均发挥着重要的作用[2]。此外，关于NO对生殖系统影响的研究也越来越深入。NO可通过多种通路来影响精子的生理功能，参与精子的发生、成熟、获能和凋亡等过程,它在提高精子活力、改善精子质量、提高胚胎存活率和促进胚胎生长等方面均发挥着重要作用。

1 NO的定位和合成

NO是一种自由基，由L-精氨酸通过一氧化氮合酶(NOS)合成[3]。NO广泛存在于生物体各个部位，例如血管内皮细胞、心室内皮细胞、巨噬细胞、非胆碱能神经末梢和血小板等[4]。据报道，在舒张血管平滑肌和抑制血小板黏附聚集等方面发挥着重要作用[5]。此外，NO对生殖系统也有重要影响。NO参与调节胎盘内血管张力和激素分泌、月经期间血小板活化、抑制子宫收缩等过程[6]。此外，NO广泛存在于睾丸、输精管、前列腺、阴茎等男性生殖器官中，对精子的发生、获能与受精等一系列生理过程有重要影响。NO的分解途径有多种，一种是与O2反应形成亚硝酸盐[7]，一种是与血红蛋白反应形成硝酸盐而分解[8]。此外，NO与硫醇和其他活性氧(ROS)的快速反应也可能是其分解代谢途径之一[9]。

NO的合成方式分为内源性和外源性2种，NOS是内源性NO合成中最主要的限速酶，根据其对Ca2+和钙调素(CAM)的依赖性，将其分为神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)3种[4]。其中，nNOS和eNOS呈Ca2+依赖性，其活性受Ca2+和CAM浓度的调控，而iNOS活性则不受Ca2+和CAM浓度的影响，呈Ca2+非依赖性。研究发现，eNOS和nNOS主要分布于精子头部，而iNOS则定位于精子顶体和尾部[10]。3种类型的NOS在精子的多种生理活动中发挥着重要的作用。

2 NO对精子功能的影响

2.1 NO对精子发生的影响精子发生是一个非常复杂的过程。精原细胞分化为精子需要多种类型细胞、激素、旁分泌因子和表观遗传调控因子的参与。研究发现，发育中的生精细胞必须从生精上皮的基底部转移到顶端区外，期间需要通过锚定连接、紧密连接和间隙连接等来协助生精细胞运动，eNOS和iNOS在此发挥积极的作用。同时，这2种NOS可能通过下游的可溶性鸟苷酸环化酶/cGMP/蛋白激酶G信号通路来调节睾丸中紧密连接和黏附连接结构，从而影响精子发生过程[11]。此外，过多的NO可影响生精细胞的增殖[12]。精索静脉曲张时，巨噬细胞和睾丸细胞会产生过量的NOS，从而使NO大量生成[13]，过量的NO会抑制线粒体内呼吸链酶活性，使生精细胞数量减少影响精子发生过程[14]。除此之外，高温也可影响NO的生成，仕志达等[15]利用阴囊热应激法研究发现，经阴囊热应激后，精液NO浓度增加，精子DNA受到损伤，诱导和加速了生精细胞和精子的凋亡，影响精子发生过程。低浓度NO对精子生成有促进作用。但其对精子发生的调节通路尚不清楚。

2.2 NO对精子活力的影响NO 具有双重性，低浓度NO(硝普钠(SNP)10-9～10-8mol/L)对精子的多种生理活动均有促进作用，而高浓度(SNP>10-5mol/L)则会损伤精子的功能，抑制一系列精子活动[16]。WANG等[17]利用SNP(NO供体)和L-NAME(左旋硝基精氨酸甲酯，一种NOS抑制剂)控制NO浓度来检测精子活力从而证明了这个观点。有研究表明，低浓度NO可通过清除自由基和抑制超氧阴离子(O2-)的产生来提高精子的活力[18]。而高浓度NO则通过抑制细胞呼吸和三磷酸腺苷(ATP)产生导致细胞中ATP的减少，从而使精子活力降低[9]。高浓度NO与超氧化物(O2-)形成过氧亚硝酸盐(ONOO-)时，对精子损害最严重，ONOO-可通过抑制线粒体呼吸进而影响精子活力[19]。目前研究发现，高浓度NO可直接引起蛋白质的翻译后修饰，通过可逆的S-亚硝基化或不可逆的酪氨酸硝化影响精子活力[20]。此外，一些影响精子活力药物就是通过调节NO浓度发挥作用。BANIHANI等[21]在研究咖啡因对精子影响时发现，咖啡因能显着增加肌酸激酶的活性，改变精浆中的NO和游离钙浓度。咖啡因对弱精症患者有很好的治疗效果，可显著提高精子活力。HEEBA等[22]研究发现，瑞舒伐他汀可通过降低iNOS、NF-κB和Caspase-3的表达来抑制睾丸炎症和细胞死亡，进而提高患者精子数量和活力。

2.3 NO对精子凋亡的影响近年来研究普遍认为NO与精子凋亡有关。NO是生殖细胞多种信号转导途径，研究发现NO的产生是精子凋亡信号转导的一部分[23]。通常凋亡信号通路包括线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路。TRAORE等[24]研究发现，Fas/FasL信号通路是生殖细胞主要的凋亡通路。Fas/FasL信号通路是死亡受体信号通路之一，Fas为死亡受体，其介导的细胞凋亡调控路径为：FasL与Fas结合导致Fas胞内的死亡域形成三聚体而活化，并引起与之结合的相关死亡结构域构象改变，使Caspase-8前体集聚、断裂和激活，产生有活性的Caspase-8，从而激发一系列下游的Caspase级联反应，进而诱发细胞凋亡[25]。当其受到NO的刺激时，FasL可以通过泛素-蛋白酶体信号通路从而诱导转换酶抑制蛋白(c-FLIP)降解[26]，此通路可能与精子凋亡相关。除此之外，精子凋亡还可能与ONOO-对精子的伤害相关。NO可能与O2-快速反应形成剧毒物质ONOO=，ONOO-通过直接氧化反应或与脂质、DNA和蛋白质相互作用。这些反应会触发细胞反应，包括引起细胞信号调节和氧化性损伤使细胞坏死或凋亡[25]。ZHANG等[27]在研究阴囊热应激后精液NO浓度时发现，阴囊热应激可诱导精子凋亡，与阴囊热应激前相比，精液中NO浓度升高，认为NO与精子凋亡相关，高浓度NO可诱导精子凋亡。

2.4 NO对精子获能的影响精子获能是指精子获得穿透卵母细胞透明带能力的生理过程，是精子在受精前必须经历的一个重要阶段。精子获能对后续的一系列生理过程有着重要的影响。其涉及由胆固醇降低引发的质膜变化，也会影响细胞内离子浓度和特定酶(例如蛋白激酶A)的活性[28]。STAICU等[29]在研究体外猪精子获能时发现，猪精子NOS分布与调节精子获能的信号通路有关。当抑制NOS时，猪精子的3种蛋白激酶A的底物磷酸化水平就会下降，获能精子数量下降。他们还发现添加NO抑制剂后会降低精子内源钙离子的浓度，而精子获能的关键步骤就是调控内源钙离子浓度。此外，在NO靶向磷酸化研究中发现，人精子获能过程需要不同蛋白质的翻译后修饰，特别是蛋白质的磷酸化，但对于不同物种来说，其动力学原理不同。一般来说，低浓度NO可以通过蛋白质S-亚硝基化和环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)通路的激活来调节精子获能[30]。激活cAMP/PKA通路会导致精子蛋白磷酸化水平的增加，尤其是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化进而促进精子获能[31]。在精子获能过程中，磷脂双向转运酶被激活，使精子膜结构改变，磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)暴露于细胞膜表面，从而影响获能过程。精子获能过程还受氧化还原调节，因此NO就会参与此过程[32]。此外，能量是精子获能和精卵结合的基本保障，精子线粒体呼吸链的氧化磷酸化可提供精子获能过程中所需的能量。杨麦贵等[33]研究发现，随着NO浓度持续升高，精子呼吸链活性下降，从而影响精子获能过程，这说明高浓度NO不利于精子获能。

2.5 NO对精子顶体反应的影响顶体反应是受精的先决条件。在精子获能后与卵母细胞结合过程中，顶体会发生一系列变化。NO作为一种信号分子，可影响顶体反应的过程。有研究表明，NO释放的化合物可通过引起环鸟苷酸(cGMP)水平的增加和蛋白激酶G的激活而诱导顶体反应的发生[34]。近年来的研究发现，NO可通过调节蛋白质磷酸化进而影响顶体反应，其途径为NO通过激活鸟苷酸环化酶(sGC)的可溶性异构体，从而增加cGMP的浓度[35]。过多的cGMP激活cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)，导致蛋白质的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而促进顶体反应的发生[36]。据报道，L-精氨酸能够通过NO信号通路诱导猪精子的顶体反应[37]。此外AQUILA等[38]研究发现，瘦素能诱导产生NO并增加顶体反应，再添加L-NAME后，瘦素诱导的顶体反应就会被抑制，说明NO在诱导顶体反应中发挥主要作用，但其具体作用机制有待研究。此外，精子获能期间抑制NOS会减少自发顶体反应的发生[18]。

2.6 NO对精子在生殖道运输的影响哺乳动物射出精子不能与卵母细胞结合，其需要在雌性生殖道中运行的过程获得受精能力[39]。在生殖道运行过程中，精子会超激活并最终发生顶体反应，这离不开生殖道中NO对精子的影响。研究发现，大多数生殖道分泌细胞都具有NOS活性[40]。已在猪的输卵管、卵巢、卵母细胞和精子细胞中检测到NO的NOS。研究发现，猪输卵管表达的主要NOS亚型是eNOS[41]，其功能是参与调节输卵管运动、排卵、卵母细胞减数分裂和激活、精子获能和配子互作[10]。大麻素是一种脂质介质，参与多种雌性和雄性生殖功能的调节。OSYCKA-SALUT等[39]研究发现，大麻素可能通过在精子获能过程中激活NO通路来调节精子从输卵管上皮细胞的释放过程。另有研究发现，在孕酮诱导的精子顶体反应过程中，NO能够激活环氧合酶，提高前列腺素E2合成[34]。前列腺素E2能延缓受精卵在输卵管内的运行。以上研究表明NO可以影响精子在输卵管中的运输过程，进而影响精子获能、顶体反应、受精等一系列生理过程。

2.7 NO对精子受精的影响精子受精过程离不开NO的参与，而且NO对精子的体内、体外受精均有影响[29]。精子完成受精要经历一系列过程，包括精子获能、顶体反应等，其均受NO的影响，适宜浓度的NO对其均有促进作用。因此，精子体内受精过程离不开NO的参与。NO在体外受精的研究较少，FRANCAVILLA 等[42]认为NO对精子体外受精的作用是间接的，其通过促进决定受精成功的精子功能来影响受精。STAICU等[29]研究发现，NO是通过调节精子获能过程和促进精子与透明带结合来影响体外受精。FRANCAVILLA等[42]还发现在体外受精前降低NO浓度会影响精子的体外受精效果。由此推测，NO参与维持精子的受精能力。此外，NO对受精过程中卵母细胞激活也有影响，有研究发现NO可通过调节Ca2+依赖的sGC/cGMP通路[7]来激活卵母细胞。由此表明，NO在精子体内与体外受精中均发挥着重要的作用。

3 小结

NO是体内重要的气体信号分子，参与身体各项生理活动，对生殖系统也有重要的影响，尤其是雄性生殖过程。NO与NOS参与精子的发生、获能、顶体反应和凋亡等一系列生理过程。NO的作用具有双重性，低浓度可以提高精子活力、促进精子获能过程，而高浓度则会抑制。此外，目前已经研究发现NO促进或抑制精子功能的多种调节通路，如NO促进精子活力的相关通路和NO调节精子凋亡的相关通路。但有关NO对精子顶体反应、受精与在生殖道中的运输的影响的具体机制尚不明确还有待深入研究。