内质网应激诱导的自噬在冷暴露诱发小鼠肾脏损伤中的作用

韩 琦，杨焕民，李士泽，张 旭，逯静静，徐 彬

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319)

越来越多的研究证据表明，环境的异常变化对机体有着较大的影响，会影响代谢、呼吸、血液循环，还会增加死亡率。寒冷作为北方常见的应激原，是制约畜牧业发展的重要因素。长期暴露在冷环境中，会引起机体的应激反应。冷应激会降低动物机体的抵抗力，增加患病的风险。因此探明冷应激对机体功能的影响，对阐明冷应激的机理以及防止寒冷伤害具有重要意义。

肾脏作为人体泌尿系统中最重要的器官，在血液循环中，承担着滤过代谢废物并排出体外及重吸收各种营养物质的重要使命。有研究表明低温会损伤肾小管上皮细胞[1]，导致肾功能下降，进而造成肾脏的损伤。有文献指出，内质网应激(ERS)会参与肾脏损伤的过程[2]。

内质网(ER)是一种多用途的细胞器，存在于大多数细胞中，其主要功能之一是对新生成蛋白的翻译后折叠和对错误折叠蛋白的再加工[3]。ER功能易受外界环境变化影响，如氧气供应不足等会破坏ER腔内稳态，引起ER功能损伤，导致未折叠及错误折叠蛋白的堆积，诱发ERS[4-7]。细胞为了降解ER中堆积的未折叠蛋白会启动未折叠蛋白反应(unsaturated polyester resins,UPR)。研究发现，真核细胞通过3种不同的机制处理UPR，第1种是增强对未折叠蛋白的折叠；第2种是降低对蛋白质的翻译；第3种是通过ER的降解作用降解未折叠和错误折叠蛋白[8]。UPR具有双重性，短暂的ERS作用下UPR能够帮助细胞回归稳定状态，但在严重和持久的ERS条件下，因UPR的适应性不能消除堆积的未折叠蛋白，ER功能恢复正常状态而导致机体产生的其他机制[9]。综上，本试验旨在探究冷暴露对肾脏造成损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物5周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠(体质量为22～24 g)，购于辽宁长生生物技术股份有限公司。在人工智能气候室中：(24±2)℃，40%相对湿度下，明/暗：12 h/12 h，小鼠自由饮水进食。

1.2 试验方法将5周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为室温对照组和冷暴露组。室温对照小鼠于(24±2)℃环境中饲养。冷暴露组小鼠在早上8点到晚上8点之间随机在4℃环境中刺激3 h，共刺激3周。

1.3 主要仪器人工智能气候室(济南旭邦电子科技有限公司)、酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)、电泳仪、电泳槽(BIO-RAD，美国)、化学发光数字成像系统(BIO-RAD，美国)、球磨仪(弗尔德仪器设备有限公司)。

1.4 主要试剂BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒均购于碧云天生物技术有限公司；HRP-山羊抗小鼠二抗、HRP-山羊抗兔二抗；P-eiF2α、eiF2α、XBP1、GRP78、Chop、LC3、P62、Beclin1、ATG7一抗(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.5 q-PCR检测肾脏组织中TNF-α、IL-1β mRNA的表达向肾脏组织中加入1 mL TRIzol 进行RNA提取，反转录成cDNA，最后进行扩增。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.6 HE染色取小鼠肾脏组织，用4%的多聚甲醛固定，包埋，切片，二甲苯脱蜡，水化，苏木精染色，分化，伊红染色，脱水，封片，最后用显微镜观察。

1.7 对小鼠肾脏ERS和自噬相关蛋白表达的检测剪取肾脏组织样本，提取总蛋白。用BCA蛋白检测试剂盒测定样品蛋白浓度，根据标准曲线计算出蛋白浓度，样品按统一浓度用RIPA稀释，加入Buffer混匀，煮沸7 min。蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移至PVDF膜上，在5%脱脂奶粉中室温封闭2 h，4℃孵育一抗，室温孵育二抗。最后用Image Lab软件对蛋白灰度进行分析。

2 结果

2.1 肾脏组织中TNF-α、IL-1β mRNA的表达与对照组相比，冷暴露组小鼠肾脏组织中TNF-α、IL-1β mRNA的表达显著升高(图1)。

***. P<0.001； **.P<0.01。下同

2.2 慢性冷暴露后小鼠肾脏的病理学变化HE染色结果可观察到与对照组相比，冷暴露组小鼠肾脏组织中炎症细胞增多，肾小管上皮细胞可见变性坏死(图2)。

A.对照组小鼠肾脏组织结构； B.冷暴露组小鼠肾脏组织结构

2.3 慢性冷暴露对小鼠肾脏ERS的影响蛋白质免疫印迹试验结果表明，与对照组相比慢性冷暴露组内小鼠肾脏内质网应激相关蛋白(p-eiF2α、eiF2α、CHOP、XBP1、GRP78)蛋白的表达水平升高(图3)。

A.Western blot；B.p-eiF2α/eiF2α比值;C.XBP1相对表达水平;D.GRP78相对表达水平;E.CHOP相对表达水平

2.4 慢性冷暴露对小鼠肾脏自噬的影响蛋白质免疫印迹试验结果表明，与对照组相比慢性冷暴露组小鼠肾脏自噬相关蛋白(ATG7、Beclin1、LC3、P62)蛋白的表达水平升高(图4)。

A.Western blot；B.ATG7相对表达水平;C.Beclin1相对表达水平;D.LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值;E.P62相对表达水平

3 讨论

在北方高寒地区，低温环境对畜禽养殖造成了很大的影响。徐晶等[10]研究发现急性冷暴露会影响仔猪肾脏的功能。本课题组前期试验猜测冷暴露对小鼠肾脏功能也会有影响。于是本试验对肾脏相关的血液生化指标尿素、肌酐及尿酐比的水平进行了检测。肌酐水平可以反映出肾小球滤过功能受损的程度[11]。试验结果显示与对照组相比，冷暴露组小鼠肌酐水平升高，这提示冷暴露可能影响肾脏的功能，与本研究猜想相符合。

肾脏是机体一个重要的器官，其可以清除体内代谢产物并重吸收有用的物质。叶翠[12]研究发现肾小球滤过功能受损会导致肾病的发生。根据组织学和q-PCR结果显示，冷暴露组小鼠肾脏组织中有炎症细胞的浸润，炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA表达显著升高。这表明慢性冷暴露会促进肾脏发生炎症反应。

已有研究证实ERS的激活参与肾小囊上皮细胞损伤、肾小球系膜细胞损伤及肾小管上皮细胞损伤[13]。因此本试验检测了ERS相关蛋白GRP78、XBP1的表达。GRP78主要参与UPR，当未折叠蛋白在ER中累积时，GRP78与跨膜蛋白分离，使跨膜信号蛋白聚集，感应并传递UPR信号[14-15]。XBP1可作为ERS的传感器，调控UPR。同时有报道称ERS激活会引起凋亡基因CHOP表达升高，CHOP的过度表达触发凋亡途径，使细胞发生凋亡[16]。本试验中，CHOP、GRP78和XBP1在冷暴露组小鼠肾脏组织中表达较对照组升高。得出结论，当机体受到冷刺激后，会促进肾脏炎症反应的发生，诱发ERS。

ERS与自噬的相互作用在很多生理与病理过程中都存在，ERS可通过多种分子机制诱导细胞发生自噬[17-18]，减轻ER压力并维持细胞稳态[19]。然而，高强度或持久的应激可启动细胞依赖自噬的死亡程序。Beclin-1是自噬关键调控蛋白之一[20]，可形成 Beclin1-Vps34-Vps15 复合结构而启动自噬、促进吞噬泡成核并召募蛋白形成自噬前体[21]。eiF2α的激活是多种疾病中错误折叠蛋白积累引起自噬激活所必需的，其激活可以促进LC3的转化。LC3是参与自噬的关键蛋白[22]，其包括2种可以相互转化的形式，分别是LC3Ⅰ和LC3Ⅱ[23]。LC3Ⅱ随着自噬体膜的数量增多而增加。P62是自噬过程重要的受体，其与泛素化蛋白和LC3Ⅱ结合成复合体，启动自噬体形成[24]。在本研究中，对自噬相关蛋白的检测发现，慢性冷暴露会导致小鼠肾脏自噬激活。

综上所述慢性冷暴露会促进肾脏炎症反应的发生，引发ERS，诱发细胞自噬。而关于慢性冷暴露引起肾脏损伤的机制还需要进一步研究。