真菌毒素适配体筛选技术研究进展

郑梦瑶，叶 金, 刘洪美, 谢岩黎, 王松雪

(河南工业大学粮油食品学院1，郑州 450001) (国家粮食和物资储备局科学研究院粮油质量安全研究所2，北京 102600)

真菌毒素是真菌在生长过程中所产生的有毒次级代谢产物，目前已被鉴定出300～400种，其中对人和动物的健康构成严重威胁的主要为黄曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、伏马毒素(FB)和T-2毒素等[1, 2]，广泛存在于大麦、小麦、玉米、燕麦、花生等及其制品中，普遍具有致癌、致畸、免疫毒性、遗传毒性和神经毒性等危害，表1具体展示了不同毒素的毒性、污染分布及其限量值。据报道，目前真菌毒素的污染问题仍遍布全球，发生率可达60%～80%[3]，远超过粮农组织(FAO)对全世界粮食真菌毒素污染率25%的估计[4]，每年约造成一万亿千克的粮食损失[5]。除此之外，受真菌毒素污染的饲料也会导致动物中毒甚至死亡，并可能在动物体内蓄积，最终进入食物链[2]，对人类健康构成威胁。面对这些真菌毒素污染问题，迫切需要快速便携、高效灵敏的检测技术。目前，该类产品的研发主要依托的特异性识别元件是具有高亲和力、高特异性、高均一性等特点的抗体[6]。我国90%以上的抗体依靠进口，抗体由于价格昂贵、批次间差异性大、热稳定性差、运输保存困难等缺点阻碍了我国免疫分析技术的开发和应用。

表1 主要真菌毒素基本概况

适配体(Apt)，是一种能与多种靶标分子如毒素[7]、抗生素、分子标记物、重金属、蛋白质和细胞[8]等进行高亲和力和特异性结合的寡核苷酸分子，主要为RNA、ssDNA 2种形式。Ellington等[9]借助随机RNA文库在体外筛选得到能与有机染料结合，并具有特定结合位点的RNA分子-适配体。这种经过多轮体外指数富集筛选(SELEX)得到的靶标分子-适配体具有合成简单、化学修饰方便、热稳定性强、免疫原性小、几乎无批次间差异、易于保存运输等特点，有望取代抗体[10, 11]，适配体与抗体的特性对比见表2。尽管如此，但目前有关适配体商业化的应用仍旧很少[12, 13]，远不能满足实际所需[14]。

表2 适配体与抗体对比[10，31-37]

首先对现有真菌毒素适配体筛选方法进行了概述，并分析总结了其筛选的基本框架和各种筛选技术所筛适配体的情况以及适配体商业化应用仍旧很少的原因。在此基础上，又分析了各种筛选技术所面临的问题和挑战，以期为获得更多性能极佳的真菌毒素适配体提供参考，促进真菌毒素污染问题的解决。

1 真菌毒素适配体筛选方法概况

1.1 体外指数富集筛选(SELEX)技术

SELEX技术是适配体体外筛选的一个开端，也是各种新型筛选技术开发的切入点和参照对象。目前用于真菌毒素的SELEX技术根据其分离原理可以分为靶标固定型筛选技术，如亲和柱-SELEX、磁珠-SELEX；文库固定型筛选技术，如捕获-SELEX；和非固定型筛选技术，如氧化石墨烯-SELEX。

1.1.1 靶标固定型筛选技术

靶标固定型筛选技术是指通过一定的技术手段将靶标分子固定于诸如琼脂糖微球、磁珠、凝胶-溶胶颗粒等载体上，再结合SELEX技术获取适配体的一种改良型筛选技术。

1.1.1.1 亲和柱-SELEX

Cruz-Aguado等[32]借助亲和柱-SELEX，得到了OTA的适配体1.12.2，并设计了适配体亲和柱用于小麦粉样品OTA的检测，这是适配体在真菌毒素分析中的首次应用。同年，Gruz-Aguado等[33]又证明了荧光偏振(FP)可以检测荧光标记的寡核苷酸分子-靶标分子的位移，基于此开发了以适配体为识别元件的FP检测方法。在真菌毒素检测领域，尽管已有适配体相关检测方法的研究，但是适配体亲和力很低，只有μmol/L级别，如OTA适配体1.12.2 的Kd值为0.2 μmol/L。 Setlem等[34]引入3轮反筛得到了nmol/L级别的AFB1适配体AFLA5，AFLA53和AFLA71，其原理如图1a，大大提高了适配体的亲和力。秦鸣蔚[35]利用Sepharose 6 B免疫亲和材料作为介质，得到了DON适配体DON-A15和DON-A16。亲和柱-SELEX技术打开了真菌毒素适配体筛选的新途径，具有极高的分离效率，但其非特异性结合较高，且与靶标结合较强的序列很难洗脱，因此周期性也较长。

1.1.1.2 磁珠-SELEX(Mag-SELEX)

Stoltenburg等[36]在经典-SELEX法筛选的基础之上，创建了荧光标记磁珠-SELEX(FluMag-SELEX)，其原理如图1b。McKeague等[4]借助磁珠-SELEX，获得了FB1适配体FB139。Barthelmebs等[37]经过14轮的筛选获得了OTA适配体H12。Chen等[38]同样经过14轮筛选获得ZEN适配体8Z31。Mckeague等[39]经过15轮的筛选，获得了OTA适配体A08。Ma等[40]经过10轮的筛选，获得了AFB2适配体17。Mag-SELEX技术是目前为止真菌毒素适配体筛选中应用最多的技术，其操作简单，分离效率较高，靶标分子范围广，但其筛选周期较长，通常需要5～14轮，样品消耗量大，靶标的固定常需要对目标分子进行共价修饰，且靶标固定后会产生空间位阻，影响ssDNA与靶标的结合，进而影响筛选适配体的亲和力和特异性。

1.1.2 文库固定型筛选技术

文库固定型筛选技术是将文库固定在磁珠、琼脂糖颗粒等基质上，而使待筛靶标以游离的方式与文库进行孵育结合，此时与靶标分子结合的序列会因构象变化而从基质上解离进入溶液中，借助外加磁场，离心等方式即可获得与靶标结合的ssDNA上清液。常见的文库固定型筛选技术为捕获-SELEX(Capture-SELEX)。Zhang等[41]经过8轮的筛选获得Kd值为(15.2±3.4)nmol/L的ZEN适配体Z100，其原理如图1c。Capture-SELEX技术因无需固定靶标，从而消除了空间位阻的影响，使靶标的结合位点得以充分的暴露，保证了筛选适配体的亲和性，但文库固定一方面可能降低文库的丰度和序列的多样性，导致起始固定文库中高亲和力、高特异性核酸适配体的缺失；另一方面通过碱基互补配对方式固定的文库存在动态解离平衡过程，增加了筛选难度[42]。这些问题使得Capture-SELEX在真菌毒素适配体筛选中的应用相对较少。

1.1.3 非固定型筛选技术

目前小分子靶标筛选领域较为常见的非固定型筛选技术当属氧化石墨烯-SELEX(GO-SELEX)。

GO-SELEX具有操作简单，无需固定靶标和文库的特点。氧化石墨烯(GO)由石墨烯氧化而来，氧化后含氧官能团增多，因而可通过π-π堆积作用吸附ssDNA的碱基，而ssDNA-靶标复合物的碱基被包裹在双螺旋结构内，因此不会被吸附，进而可通过离心沉淀实现ssDNA-靶标复合物和ssDNA的分离[10]。WOOKIM等[43]首次借助GO可在非均相溶液中分离ssDNA的能力建立了非固定化GO-SELEX筛选方法，筛选了Nampt蛋白适配体。Chen等[44]借助GO-SELEX得到T-2毒素适配体Seq.16，其原理如图1d，表明了该技术可以用于真菌毒素适配体筛选。李敏[45]获得了OTA适配体Seq.14。张敏[46]获得了AFB1适配体AFB-8，并以此适配体为特异性识别探针，纳米金作为指示剂，建立了一种AFB1比色检测方法。GO-SELEX技术相较于固定筛选的方法操作更加简单，消除了靶标固定的繁琐步骤以及文库固定所带来的高亲和力和特异性适配体缺失的风险，但如果靶标会被GO吸附，则无法进行GO-SELEX筛选[10]。此外，ssDNA从GO表面自解吸附，会降低筛选的效率。

图1 技术基本原理

1.2 真菌毒素适配体筛选技术流程

图2 SELEX筛选技术基本原理[12]

随着科学技术的进步，适配体筛选技术也在不断地完善，逐步趋向于更加高效、便捷、经济等。无论是经典-SELEX还是“改良型”-SELEX，其筛选流程大致相同，如图2，可划分为[10, 42]：随机寡核苷酸文库的准备：文库由随机序列区和引物结合区组成，可以是ssDNA文库或RNA文库，其序列种类约为1015～1018种。孵育结合和分离洗脱：在特定条件下，将靶标与文库共同孵育，使之形成靶标-ssDNA复合物，借助特定的分离方法分离出靶标-ssDNA复合物，如图3、图4所示。负筛和反筛：负筛去除与磁珠等载体和离心管作用的非特异序列，反筛去除与靶分子结构类似物或环境共生真菌毒素结合的非特异序列，此外，增加洗涤次数还可除去与靶标分子结合弱的序列。PCR扩增及单链制备：对具有亲和力的序列进行PCR指数扩增富集，并借助热变性、亲和柱分离、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等分离手段，制备单链寡核苷酸，形成次级文库。重复循环：使用次级文库再次进行筛选，并重复循环若干轮，使亲和力和特异性弱的序列被逐步淘汰。测序分析：对最后一轮筛选获得的ssDNA或RNA进行克隆测序，并借助DNAMAN、RNA Structure等软件进行序列结构分析，选出适配体候选序列。亲和力和特异性分析：可借助微量热泳动技术、荧光法、酶联免疫吸附法、表面等离子共振法、等温滴定量热法等方法进行亲和力特异性分析。

图3 固定筛选技术原理[34, 47]

图4 非固定筛选技术原理[48]

表3 已报道的真菌毒素适配体序列

1.3 所筛真菌毒素适配体情况及商业化应用实际情况

经过SELEX获得的适配体，具有化学修饰方便、热稳定性强、免疫原性小、几乎无批次间差异等特点，有望成为协助农作物生产加工过程中真菌毒素实时检测和监控技术开发、靶向降解等的工具[49-52]。目前已报道出多种适配体见表3，但有关适配体商业化应用仍旧很少[12, 13]，远不能满足实际所需[14]。究其原因主要有：适配体本身异质性太大，其构象易受环境如温度、pH值的影响，表面固载模式下适配体易酶解导致稳定性差、寿命短等问题，并且缺乏统一标准的适配体评价方法，主要表现为：同一靶标可存在多种适配体，且适配体长度不一；不同长度序列的适配体其构象性质不同；同一适配体在不同的应用环境中所表现出的性能也各不相同等。真菌毒素适配体“黑匣子”式的筛选方法存在筛选过程耗时，劳动强度大，经费耗损严重，效率低，重复性差，且所筛适配体性能无法保证等问题。与大分子靶标筛选相比，小分子靶标特异性结合位点少[53]，与适配体结合前后分子量变化小，因而固定、分离困难，且更易受环境基质影响，导致所筛适配体与靶标没有亲和活性，增大了筛选的难度。

2 真菌毒素适配体筛选技术所面临的问题和挑战

全方位了解现行真菌毒素适配体筛选技术所面临的问题和挑战有助于推动小分子靶标适配体筛选进程，进而促进更多高亲和力、高特异性适配体的产生，为适配体相关应用奠定夯实的基础。如表4所示，各种适配体筛选技术都存在一定的局限性。

2.1 靶标固定型筛选技术

靶标固定型筛选技术在小分子靶标适配体筛选中，常常会因为小分子物质结合位点少、难以固定等导致筛选困难、周期性较长、且价格较为昂贵等问题。其固定一般会采取一定的手段进行修饰或转化靶标分子，如王文凤[60]借助甾族化合物羧基化反应，将羧基修饰在AFB1和AFB2上，使其能够通过酰胺反应固定在氨基化磁珠上。同样Chen等[38]为将ZEN固定在氨基化磁珠上先将其改造为玉米赤霉烯酮-肟(ZENO)，使其分子结构中带有一个羧基，再通过酰胺反应固定在氨基化磁珠上。在修饰或转化的过程中，不免会存在靶标分子修饰过度、活性位点转变或丢失等问题[47]，且靶标固定后会产生空间位阻，进而影响ssDNA与靶标的结合，因此需要一系列表征，这无疑会增大劳动强度和科研经费的使用。此外，固定基质的引入，也会造成非特异性结合，进而加大了筛选难度。

2.2 文库固定型筛选技术

文库固定型筛选技术虽不需要固定靶标，避免了靶标过度修饰、活性位点转变或丢失、非特异性结合等问题，但文库的固定限制了ssDNA的多样性，以及文库的丰度，有可能造成原始文库中优良适配体的缺失。另外，当文库与靶标孵育结合时，若目标序列不能产生构象变化或产生很弱的构象变化，则很难与基质分离，导致筛选失败。通过碱基互补配对方式固定的文库存在动态解离平衡，使得不与靶标结合的序列也从文库固定基质上解离落入溶液中，造成部分假阳性，降低筛选效率，增大筛选难度。

表4 主要真菌毒素适配体筛选方法所面临的问题和挑战

2.3 非固定型筛选技术

非固定型筛选技术相较于固定筛选操作更加简单，消除了因固定所带来的一系列问题，在小分子靶标筛选领域最常见的非固定型筛选技术为GO-SELEX，GO对ssDNA独特的吸附作用使得靶标-ssDNA与ssDNA分离，若靶标会被GO吸附，则无法使用GO-SELEX进行筛选，因此靶标范围较窄。此外，非特异性序列从GO表面自解吸附，会降低筛选的效率，增加筛选难度。Kou等[61]表示GO表面的吸附能力与核酸序列的长度有关，对短链吸附能力较长链弱，可以推断：GO对短链吸附弱，自解性强，易导致部分假阳性；而对较长链吸附较强，难以从GO上脱落，导致分离困难，降低筛选效率。由此可知，GO-SELEX文库中核酸序列长度的选择对适配体筛选是否成功起着至关重要的作用。

3 总结和展望

目前用于真菌毒素适配体筛选的技术主要有亲和柱-SELEX、Mag-SELEX、Capture-SELEX、和GO-SELEX，其各自均存在着一定的缺陷，诸如筛选周期长、靶标固定步骤繁琐且困难、非特异性结合、寡核苷酸文库丰度和多样性较低、且固定方式对筛选的难易程度影响较大、靶标范围小、效率较低等。除此之外，“黑匣子”式的筛选方法还存在经费耗损严重，重现性差，且所筛适配体性能无法保证等问题。而适配体本身异质性又大，其构象易受环境如温度、pH值的影响，表面固载模式下适配体易酶解导致稳定性差、寿命短等，这都限制了适配体的商业化应用。

未来，可针对现有真菌毒素适配体筛选技术进行改进优化从而促进多样化筛选技术产生，比如，无需固定且可同时筛选多个靶标适配体的微流控-SELEX技术；可实时测量靶标与适配体亲和力的石英晶体微天平-SELEX技术；以及可高效分离，样品用量少，筛选成本低的毛细管电泳-SELEX等，从而有助于挖掘更多可适用于不同基质的真菌毒素高亲和力、高特异性适配体，再借助适配体易于修饰的优点，实现真菌毒素适配体在农产品、饲料、食品以及中药材等实际样品中的商业化应用。