不同品种大豆多酚含量与其抗氧化性的关系研究

杨鑫鑫，黄雨洋，衣程远，李 颖，郭汝杞，朱秀清

(哈尔滨商业大学食品工程学院；黑龙江省谷物食品与谷物资源综合加工重点实验室，哈尔滨 150028)

大豆是一种高蛋白、高脂肪的豆类植物，其中还含有维生素、多酚等活性成分，具有独特的营养价值，一直是中国人食用蛋白质的主要来源。大豆中多酚质量分数较高(5%)，且由于多酚对自由基有很强的清除能力，大豆被称为天然的抗氧化食品[1-3]。

多酚中至少含有一个带羟基的芳香环，在植物中最常见分布最广是人类饮食中最丰富的抗氧化剂[4,5]。多酚在氧化反应中起到还原剂的作用，通过氢原子转移或单电子转移机制而使其具有抗氧化能力[6-8]。Xu等[9]和朱怡霖等[10]研究表明，随着多酚含量的增加其抗氧化能力也增大，但是目前对多酚含量和测定各种抗氧化能力指标之间的相关性还鲜有研究和报道。

铁还原力、总氧自由基清除力、总自由基捕获能力、DPPH、ABTS以及清除活性氧自由基能力等都是评价抗氧化能力的指标[11,12]。本研究以20种大豆品种为原料，通过测定总酚含量以及4种抗氧化能力DPPH、ABTS、铁还原能力和羟自由基清除率，利用主成分分析法筛选抗氧剂能力最强的大豆品种以及确定评价大豆抗氧化能力的主要指标。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20种大豆品种：黑农83、黑农61、黑农52、黑农69、黑农64、绥农56、黑农66、黑农87、黑农62、黑农48、绥农50、黑河43、金源55、绥农43、东农252、东富3号、合丰55、黑河53、东农小粒豆1、佳密豆6号。

Folin-Ciocalteu试剂、DPPH试剂、ABTS试剂、水杨酸、铁氰化钾、石油醚、甲醇均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Alpha-1506型紫外-可见分光光度计，SB-5200DTD型超声波清洗机，FA224型分析天平，TDL-5-A型台式离心机，R-205型旋转蒸发仪。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

取各参试大豆粉碎过筛，准确称取5.0 g样品，加入50 mL石油醚震荡脱脂24 h，在40 ℃下用100 mL 80%的甲醇溶液超声提取2次，每次30 min，然后4 000 r/min离心15 min，收集上清液，残渣以同样的方法重复提取2次，合并3次提取液，45 ℃旋转蒸发后用甲醇定容至50 mL，于4 ℃冰箱保存备用[13，14]。

1.3.2 多酚含量测定

参考张清安等[15]的方法，采用Folin-Ciocalteau法测定多酚含量。准确移取1.3.1中的提取液1.0 mL，分别加入10 mL蒸馏水和1.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，摇晃30 s至均匀，静置5 min后加入10% Na2CO36.0 mL，加水定容至25.0 mL，置于30 ℃水浴避光反应2 h，用1 mL 80%甲醇代替样品做空白，在765 nm波长处测定吸光度A。以没食子酸作标准品代替样品作标准曲线，得到回归方程y=5.253 5+0.035 2x，R2=0.990 7。样品中的总酚以没食子酸的含量表示，单位为 mg/g。根据式(1)计算多酚含量。

X=(C×50×A)/m

式中：X为试样中的多酚含量/mg/g；C为试样测定液中没食子酸的浓度/mg/mL；A为样品稀释倍数；50为试样测定液定容体积；m为试样的质量/g。

1.3.3 DPPH自由基清除能力测定

选取黑农83为试样，将其配制成质量分数为10%、20%、30%、40%、50% 5个梯度，按以下方法测得各浓度样液对DPPH的清除率，由此计算该样液的IC50值，IC50=0.159 4 mg/g。其余样品的提取液按黑农83样液的IC50进行稀释其稀释倍数为13%。

参照文献[16]的方法测定DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由清除率：准确移取1.3.1提取液2.0 mL，加入1，1-二苯基-2-三硝基苯肼溶液(2.0 mL)，避光反应20 min后测定其吸光值A1(517 nm)；在相同条件下对照组测得的吸光值为A2(无水乙醇代替DPPH)，空白组测得吸光值为A0(无水乙醇代替样液)。按照式(2)计算样品对DPPH自由基的清除率。

DPPH.清除率=[1-(A1-A2)/A0)]×100%

(2)

式中：A0为空白组的吸光值；A1为样品的吸光值；A2为对照组的吸光值。

1.3.4 ABTS自由基清除能力测定

IC50测定：选取黑农48为试样，将其配制成质量分数为20%、40%、60%、70%、80% 5个梯度，按下面的方法测得各浓度样液对ABTS的清除率，由此计算该样液的IC50值，IC50=0.278 7 mg/g。其余样品的提取液按黑农48样液的IC50进行稀释其稀释倍数为24%。

参照CENGIZ S的方法测定ABTS自由基清除率[17]：准确移取1.3.1提取液0.1 mL加入3.9 mL 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐溶液，避光反应20 min后测定其吸光值A1(734 nm)；在相同条件下对照组测得的吸光值为A2(无水乙醇代替ABTS)，空白组测得的吸光值为A0(无水乙醇代替样液)，按照式(3)计算样品对ABTS自由基的清除能力。

ABTS自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0)]×100%

(3)

式中：A0为空白组的吸光值；A1为样品的吸光值；A2为对照组的吸光值。

1.3.5 羟自由基清除能力测定

采用水杨酸法测定羟自由基清除能力[18]：准确移取1.3.1提取液0.5 mL加入H2O2(5 mL)摇匀后测定其吸光值A1(510 nm)；在相对条件下，对照组测得的吸光度为A2(用蒸馏水代替硫酸亚铁溶液)，空白组测得的吸光度为A0(用蒸馏水代替样品溶液)，按照式(4)计算样品对羟自由基清除能力。

羟自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0)]×100%

(4)

式中：A0为空白组的吸光值；A1为样品的吸光值；A2为对照组的吸光值。

1.3.6 铁还原力测定

参照文献[19]等的方法采用铁氰化钾法测定铁还原力：铁还原力大小用铁氰化钾法测定的吸光值大小来表征。

1.4 统计方法

所有数据均平均测定3次，取其平均值，采用SPSS 26.0软件进行主成分分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 大豆品种的多酚含量及抗氧化能力相关性分析

如图1所示，随着20种大豆品种的不同，其多酚含量、DPPH/ABTS自由基清除能力、铁还原能力和羟自由基清除率也不同。不同大豆品种的抗氧化能力不同可能是由于多酚含量不同造成的，因为多酚类物质含有的芳香族特征的结构和多羟基高度共轭体系，它们具有优异的还原性能，可以中和其他活性氧，有效清除自由基，能够作为抗氧化剂，因此多酚含量的不同会直接影响大豆的抗氧化能力[7,20]，这与Xu等[9]和朱怡霖等[10]的研究结果一致。

评价物质抗氧化性能力的方法有许多种，每种方法都有其特定的目标对象以及反应机理。本研究测定大豆抗氧化能力的4种方法中铁还原力测定的是体外总抗氧化能力、DPPH和ABTS自由基清除能力测定的是清除自由基能力、羟自由基清除率测定的是清除活性氧自由基能力[12]。因此这3类方法可以从不同机制评价不同大豆品种的抗氧化能力。

图1 不同品种大豆的总酚含量、自由基清除能力、铁还原能力的变化

大豆抗氧化活性的主要贡献之一是酚类化合物的含量，总酚含量与大豆抗氧化能力评价指标(DPPH/AABTS自由基清除能力、铁还原能力和羟自由基清除率)的相关系数如表1所示。在本研究中，多酚含量与铁还原能力和羟自由基自由基清除率呈极显著相关性(P<0.01)，与ABTS自由基清除率显著相关(P<0.05)，与DPPH自由基清除率无显著相关性，这可能是因为1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)与多酚类物质的反应不成相关性。

表1 大豆的抗氧化能力和总酚含量的相关系数

因此，大豆多酚含量和3种类型的抗氧化能力之间有着直接的相关性，证明它们之间存在着信息的重叠，其中大部分相关系数都大于0.3，因此这5个指标适合在主成分分析中做因子[21]。通过比较5个单一指标，每个品种都存在优劣，很难对大豆抗氧化能力进行综合评价，因此需要通过主成分分析建立一套评价大豆抗氧化能力的体系。

2.2 基于主成分分析筛选评价抗氧化能力的指标

本研究的主成分分析是利用降维思想，在保证5个指标的信息最大程度被保留的前提下把5个指标转化为几个综合指标的多元统计方法，其中每个综合指标(主成分)都是原始变量的线性组合，且互不相关，这就使得主成分比原始的5个指标更能评价大豆的抗氧化性[22]。

2.2.1 数据标准化处理

表2 不同品种大豆多酚含量及抗氧化能力的标准化结果

2.2.2 主成分提取和贡献率

本研究利用SPSS 26.0 对20种大豆品种的总酚含量及抗氧化能力(DPPH/AABTS自由基清除能力、铁还原能力和羟自由基清除率)共5 项指标进行了主成分分析，结果见表3。

由表3可知成分1和成分2的特征值均大于1，因此提取这2个因子作为主成分，解释了原有变量总方差的78.09%，可代表原品质性状的绝大部分信息，根据综合评价的需要，采用这2个主成分来代替原来的5个指标变量[23]。结合表4不同品种大豆抗氧化能力的荷载值，可知第一主成分的特征值为2.73，贡献率为54.54%，代表了20种大豆品种抗氧化能力测定结果54.54%的信息。第一主成分主要要以多酚含量和铁还原力影响为主，羟自由基清除率为辅，这说明评价大豆抗氧化能力的主要指标是多酚含量和铁还原力。第二主成分的特征值为1.18，贡献率为23.55%，代表了20种大豆品种抗氧化能力测定结果23.55%的信息，第二主成分主要以DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率影响为主。

表3 主成分的特征值及贡献率

2.2.3 特征向量计算

表4为不同品种大豆抗氧化能力的载荷矩阵，可以代表各变量对主成分的影响程度，其绝对值越大表示对主成分的影响越大。由表4可知多酚含量和铁还原力是影响主成分1的主要因素，羟自由基清除率是次要因素；ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率是影响主成分2的主要因素。这说明当多酚含量和铁还原力高时，第1主成分较大，DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率高时，第2主成分较大。

表4 不同品种大豆抗氧化能力载荷矩阵

表5 各指标的成分系数得分矩阵

根据表3中的特征值和表4中各主成分载荷系数除以主成分相对应的特征值开平方根，可以得到表5中各性状指标的成分系数得分矩阵，通过表5可以分别得到2个主成分的函数表达式F1、F2：

F1=0.57X1+0.30X2+0.33X3+0.42X4+0.55X5

Vasu 1897: Śrīśa Chandra Vasu, The Aādhyāyi of Pāini, Benares: Sindhu Charan Bose at the Panini office.

F2=-0.12X1+0.58X2+0.52X3-0.61X4-0.03X5

F=0.545F1+0.235F2

最终得到方程F=0.282 5X1+0.299 8X2+0.302X3+0.086X4+0.292 7X5

式中:X1为多酚含量；X2为DPPH自由基清除率；X3为ABTS自由基清除率；X4为羟自由基自由基清除率；X5为铁还原能力。

将2个主成分以及各主成分对应的方差贡献率作为权重，得到综合评价函数：

F=0.545F1+0.235F2，结果见表6。

2.2.4 大豆抗氧化活性综合评价

把方程代入数据可得最终的排序，见表6。

表6 20种大豆品种的主成分分析综合得分与排名

表6为20种大豆品种的主成分分析综合得分与排名，分数越高代表大豆品种的抗氧化能力越强，其中F1和F2的得分表示2个主成分的得分，结合表3和表4可知第一主成分中以多酚含量和铁还原力的影响最为显著，且第一主成分可以代表大豆抗氧化能力测定结果54.54%的信息。绥农56的综合主成分值为1.28分，是20种大豆品种中综合主成分的最高值，这说明在这20中大豆品种当中，绥农56的抗氧化能力最强，它的第一主成分综合值F1也最高，达到了2.17分，在20种大豆品种中绥农56的多酚含量和铁还原力分别排第三和第四，这说明用综合主成分值能较客观地反映各品种间的品质比较。黑农48、黑农61、黑河53、黑农64的综合分值为1.1、1.0、0.9、0.69，均在0.5分以上，都是抗氧化能力较强的大豆品种，这些品种的多酚含量和铁还原都较高。东农小粒豆1和合丰55的综合评分为-1.85和-2.06是得分最低的两种品种，也是总酚含量和铁还原能力最低的2种大豆品种。

因此，在评价大豆抗氧化能力时多酚含量和铁还原力是最重要的两个指标。这说明多酚具有较强的抗氧化能力，含量多少能直接影响大豆的抗氧化性。4种评价大豆抗氧化能力的指标中铁还原力最能反映大豆的抗氧化能力，它测定的是大豆的体外总抗氧化能力。

3 结论

对20种大豆品种进行了总酚含量及其抗氧化能力的测定，相关性分析表明总酚含量与羟自由基清除率和铁还原能力极显著相关(P<0.01)，与ABTS自由基清除率显著相关(P<0.05)，与DPPH自由基清除率无显著相关性。对20个大豆品种的5个指标进行主成分分析，共提取了2个主成分，第1主成分主要要以多酚含量和铁还原力影响为主，贡献率为54.54%，结合综合排名分析证实多酚含量和铁还原力2个指标可以作为评价大豆抗氧化性的主要指标。从主成分分析综合评分得到绥农56的种子抗氧化能力最强，其次是黑农48、黑农61、黑河53、黑农64，这些种子的抗氧剂能力较强，东农小粒豆1和合丰55的抗氧化能力最弱。