母亲孕期同型半胱氨酸、叶酸及相关基因多态性与子代发生先天性心脏病的关系

段素霞 赵梦川 张丽霞 赵紫薇 陶曙光 金立臣 宋海龙 崔晓薇 李贵霞

先天性心脏病(congenital heart disease, CHD)是指胎儿在宫内发生的心脏或大血管结构异常而引起的先天性心血管畸形，是一种最常见的出生缺陷，其发病率在活产婴儿中为0.05%～13.8%[1]。已知的CHD病因除少数是由单基因突变或染色体畸变外，大多数的CHD被认为是由环境因素和遗传因素共同作用的结果[2-4]。大量研究结果提示，高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血症可能与CHD的发生有关，而叶酸与Hcy的代谢密切相关，叶酸缺乏可使Hcy水平增高[5]。参与叶酸转运及代谢的关键酶包括5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylene tetrahydrofolate reductase, MTHFR)，蛋氨酸合成酶(methionine synthase, MS)以及蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase, MTRR)等。有研究认为以上基因多态性位点突变可以通过改变蛋白质的结构导致相应酶的活性减弱，从而直接或间接影响体内叶酸和Hcy水平，进一步干扰胚胎期心血管和神经等发育[6-8]。针对母亲Hcy以及叶酸水平与CHD、唇腭裂、染色体异常等多种出生缺陷的关系研究已见报道[6-9]，但对母亲在妊娠时体内的血清Hcy及红细胞叶酸水平联合相关基因多态性来分析其与子代发生CHD的相关研究尚少见。本研究通过检测孕有CHD胎儿孕妇与正常妊娠孕妇的血清Hcy、红细胞叶酸水平及MTHFR-C677T和A1298C位点、MS-A2756G及MTRR-A66G位点的基因多态性，来进一步分析其与子代CHD发生的相关性，为预防CHD提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2018年6月至2019年12月在河北省儿童医院胎儿先天性心脏病筛查中心就诊的22～30孕周的单胎孕妇共107例。根据是否妊娠CHD胎儿，将研究对象分为CHD组(n=52)和正常妊娠组(n=55)。CHD组是指经B超诊断为妊娠CHD胎儿的孕妇，正常妊娠组选取同期经B超及其他产前筛查诊断为胎儿发育正常的孕妇。本研究经河北省儿童医院伦理委员会审查同意(医研伦审第202120号)。CHD组年龄20～38岁，中位年龄28岁；平均孕周(25.3±1.1)周。正常妊娠组年龄21～37岁，中位年龄27岁;平均孕周(25.7±0.9周)。2组年龄、孕周比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 入选标准 本研究纳入的孕妇均接受B超检查及必要的产前检查，排除了妊娠期高血压、糖尿病等疾病，无放射线接触史，无不良嗜好。

1.3 方法 本研究第一时间收集其已完成临床检测的剩余EDTA-K2抗凝全血及经分离胶管离心后分离的血清样本。采用血液基因组 DNA 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取了样本的全血DNA，冻存于-80℃冰箱备用。

1.3.1 血清Hcy及红细胞叶酸的测定：采用酶循环法检测血清Hcy，检测仪器为Cobas 8000全自动生化分析仪(德国罗氏公司)，试剂盒由北京九强生物技术股份有限公司提供，严格按照说明书操作。EDTA-K2抗凝全血样本依据叶酸测定试剂盒(直接化学发光法)说明书(美国西门子医学诊断股份有限公司)进行处理，在ADVIA Centaur CP 全自动化学发光免疫分析仪(美国西门子公司)上进行红细胞叶酸的测定。

1.3.2 四个基因多态性位点的检测：以上4个基因多态性位点均采用PCR后Sanger测序的方法进行检测。采用TaKaLa Ex Taq Hot Start Version(大连宝生物工程有限公司)的PCR试剂盒，配置25 μl的PCR反应体系，其中包含无核酶水16.375 μl，10×PCR反应缓冲液2.5 μl，dNTP 2 μl，Taq酶0.125 μl，最后加入设计好的相应上下游引物各1 μl(10 μmol/L)(引物序列见表1)，模板2 μl(50～150 ng/μl)。PCR反应条件：95℃预变性3 min；进入循环：95℃变性30 s，60℃ 45 s，50个循环；最后4℃保存。对2组样本PCR后进行Sanger测序(上海生工生物工程股份有限公司)，根据测序结果判读样本的四个基因多态性位点基因型。见表1。

表1 四个基因多态性位点的PCR引物序列

2 结果

2.1 孕妇血清Hcy、红细胞叶酸与子代发生CHD的关系 CHD组血清Hcy水平(P50=7.85 μmol/L)显著高于正常妊娠组(P50=5.89 μmol/L)，差异有统计学意义(Z=-2.45，P=0.01)。2组红细胞叶酸水平(1 968.44 nmol/L vs 1 733.50 nmol/L)比较差异无统计学意义(Z=-1.64，P=0.10)。

2.2 母亲基因多态性位点与其子代发生CHD的相关性 2组标本的四个基因多态性位点基因型分布均符合HWE定律，说明其等位基因及基因型频率在人群中的遗传是恒定的，样本代表性良好。将CHD组与正常妊娠组孕妇的四个基因多态性位点分布情况进行比较，对于MTHFR-C677T位点，携带突变型等位基因T导致子代的CHD患病风险是携带野生型等位基因C个体的2.56倍(95% CI：1.47～4.47，P<0.001)。与野生型纯合子CC比较，携带杂合子CT的母亲其子代患CHD的风险较高(OR=5.37，95% CI：1.59～18.11，P=0.004)，突变型纯合子TT母亲其子代患CHD的风险是CC个体的8.04倍(95% CI：2.24～28.85，P<0.001)。MTHFR-A1298C、MS-A2756G和MTRR-A66G位点的基因型频率及等位基因频率在2组中分布差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2、3。

表2 2组孕妇4个基因多态性位点的HWE遗传平衡检验

表3 母亲4个基因多态性位点与子代发生CHD的关系

3 讨论

Hcy是蛋氨酸代谢产生的一种含硫氨基酸，具有细胞毒性，可使巯基氧化产生自由基，引起细胞损伤和细胞凋亡。有研究认为Hcy可通过氧化应激直接对胚胎产生毒性作用，其产生的S-腺苷蛋氨酸还可干扰甲基化反应，导致机体产生错误蛋白和无功能蛋白[10]，Rosenquist等[11]发现给鸡胚注射Hcy可诱发其发生室间隔缺损等多种心脏畸形。本研究显示，孕有CHD患儿的孕妇其血清Hcy水平明显高于正常妊娠组，提示母亲孕期的血清Hcy水平升高可能是子代CHD发生的危险因素。

叶酸在细胞的生长和分裂中有着重要的生理作用，与Hcy的代谢密切相关[12]。血清叶酸和红细胞叶酸水平是衡量机体叶酸营养状况最常用的两项指标。血清叶酸水平反映机体叶酸水平的早期变化，受近期膳食及吸收状况的影响较大，而红细胞叶酸水平则代表机体内肝脏等组织中叶酸的贮存情况，相对稳定并且代表了体内参与代谢过程的叶酸水平[13，14]。目前针对此类研究的报道中，机体叶酸的测定指标均采用血清叶酸水平展开，而本研究则选取了代表性更好的红细胞叶酸水平。同时，以往的研究大多针对CHD患者或是已生育CHD患儿的母亲展开，认为叶酸水平降低是CHD发生的危险因素[15,16]；笔者发现对母亲孕期中的叶酸水平与子代发生CHD的相关研究尚少见。本研究对2组处于孕期的母亲其红细胞叶酸水平进行了测量比较，并没有发现显著性差异。推测母亲孕期的红细胞叶酸水平与子代发生CHD的关联性较小，这可能是由于地域的差异、生活水平的提高或母亲孕期的饮食等在一定程度上补充了叶酸所致。

MTHFR是参与Hcy和叶酸代谢的关键酶之一。有研究发现，母亲MTHFR-C677T基因多态性与子代发生神经管缺陷、流产及CHD的概率有显著的相关性[17-19]。本研究结果表明，与野生型纯合子CC比较，携带杂合子CT的母亲其子代患CHD的风险较高(OR=5.37)，而携带突变型纯合子TT的母亲其子代患CHD的风险则更为显著，是CC个体的8.04倍，推测母亲纯合型突变对子代CHD的致病力可能大于杂合型突变。母亲携带突变型等位基因T可能是子代发生CHD的危险因素，该结论与多数国内外的研究观点[8,17]相符。

目前对于MTHFR A1298C位点的研究大部分集中于患儿本身，且结论存在争议。李栋等[18]在对150名CHD患儿进行的病例-对照研究中认为突变型等位基因C是CHD的危险因素。而Hobbs 等[8]在一篇对美国中南部人群的研究中却认为该等位基因C为CHD的保护因素。针对母亲MTHFR A1298C位点、MS-A2756G及MTRR-A66G位点与子代发生CHD的研究较为少见，本研究尚未发现母亲以上3个位点对子代CHD的发生有影响。

综上所述，CHD病因复杂，是环境与遗传相互作用的结果。本研究发现母亲孕期血清Hcy水平升高及MTHFR C677T位点的等位基因T可能是子代CHD发生的危险因素。但最终结论尚需依赖基础研究和大规模前瞻性人群调查，随着精准医疗和精准预防的推进，该研究可为出生缺陷的预防和评估提供一定的指导价值和参考意义。