沸石缓解尾菜厌氧发酵酸抑制现象的研究

付龙云郭兵李彦王艳芹井永苹张英鹏薄录吉梁晓辉

(1.山东省农业科学院农业资源与环境研究所，山东 济南 250100；2.农业农村部山东耕地保育科学观测实验站，山东 济南 250100；3.山东省科学院能源研究所，山东 济南 250014)

蔬菜产销过程中，弱秧、藤蔓、残枝等尾菜废弃物的产生难以避免，有报道指出，叶菜类、瓜果类和根茎类蔬菜的产废系数分别达9.7%、3.7%和3.8%。尾菜含水率高，蛋白质、多糖等含量丰富，极易腐败变质和滋生病菌，其有效处理不但事关可再生资源的有效利用，更关系着蔬菜产地环境安全的维护[1，2]。

厌氧发酵是一种兼具经济和环保效益的废弃物资源化利用方式。厌氧发酵全程在密闭容器中进行，不存在异味气体散发、发酵液渗出等环境问题，对周围生态的影响较小；转化效率高，消化过程中有机物化学需氧量(COD)、生化需氧量(BOD5)等指标可显著降低；消化产物——沼气、沼渣、沼液均有良好的经济价值，符合农业废弃物能源化、基质化、肥料化的利用方向。发展沼气产业，利用厌氧发酵的方法处理畜禽粪污、秸秆等农业废弃物也是近年来国家支持的重要环保举措[3]。然而，由于厌氧发酵的多阶段性和沼气微生物菌群的复杂性，相较于堆肥、基质加工等废弃物处理方式，厌氧发酵系统往往较为脆弱，对原料、接种物、过程控制等的要求更为严格，常由于酸抑制、氨抑制等原因而导致发酵失败。

以果蔬废弃物、餐厨垃圾、农产品加工废弃物等进行厌氧发酵时，原料中丰富的糖类、蛋白质、脂肪等营养物质极易被微生物分解而在短时间内产生大量丙酸、乙酸等挥发性脂肪酸(VFAs)，若VFAs浓度超过产甲烷古菌等微生物的耐受极限将出现酸抑制现象，导致厌氧发酵停滞或崩溃，这种现象在反应器有机负荷率(organic load rate，OLR)较高时尤其显著。如何预防和消除酸抑制是保障厌氧发酵正常进行的关键因素之一[4，5]。目前用于解决酸抑制的方法主要有:混合厌氧发酵、更换耐酸型接种物、两相厌氧发酵、消化过程中补加碱性物质和微量元素等，但也存在工艺复杂、设备局限性大、成本较高等亟需解决问题。

沸石是一种天然或人造的多孔性硅铝酸盐材料，比表面积大、离子交换能力强、具有很强的吸附能力，适合作为微生物的附着载体。以餐厨垃圾、禽畜粪便等高含氮物料进行厌氧发酵时，适量添加沸石可有效缓解氨抑制，促进甲烷正常产生。Kotsopoulos等[6]发现猪场污水高温厌氧发酵时添加8 g/L和12 g/L沸石，挥发性固体(volatile solids，VS)、BOD5等指标下降显著，甲烷产量大幅提高；Wang等[7]研究了芦苇、禽畜粪便和餐厨垃圾三种原料混合厌氧发酵产沼气性能，发现添加10%沸石可有效解除氨抑制和酸抑制，促进VFAs的分解转化，显著提高消化产气性能:缩短产气延滞期，提高产气速率、总产气量和甲烷浓度。

不同于餐厨垃圾和禽畜粪便，尾菜有机氮含量不突出，而糖含量较高，厌氧发酵更易受酸抑制的影响。本研究以设施蔬菜种植过程中产生的尾菜为原料，探讨沸石对厌氧发酵产气性能和pH、VFAs等关键因子的影响，特别是对酸抑制现象的缓解作用，并与常规的碱化学调控手段相比较，寻找尾菜中温厌氧发酵酸抑制的优化解决办法，以期促进尾菜这类特色可再生资源的有效利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

尾菜取自山东省临沂市某设施菜田，为芹菜、白菜和莴苣的废弃物，粉碎至1～2 cm后混合均匀并于4℃冷藏备用。接种物为从山东省某养猪场猪粪沼气装置中取出的沼渣沼液混合物。沸石为市售天然沸石，呈灰白色，粉碎至粒径小于400 μm(过40目筛)，蒸馏水冲洗后干燥备用。NaOH等均为市售分析纯产品。

总固体(TS)、挥发性固体(VS)、总碳(total carbon，TC)、全氮(total nitrogen，TN)、碳氮比(C/N)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)、粗蛋白(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，crude fat，EE)、粗纤维(crude fiber，CF)等消化原料和接种物的基本特性见表1。

表1 厌氧发酵物料的基本特性

1.2 试验装置

厌氧发酵试验装置主要由发酵瓶、集气袋、连接管以及恒温培养箱组成。发酵瓶为容积2.5 L的具塞玻璃瓶，橡胶塞上打孔并以玻璃管、乳胶连接管与集气袋相连接，物料全部装填完毕后整体放入培养箱中培养。

1.3 试验设计

采用批式中温厌氧发酵，35℃进行，试验周期30 d；各组厌氧发酵混合物TS统一设定为4%(以尾菜计)，接种物比例为20%，以无菌水补足至2 000 g并统一调节初始pH至7.00。共设4个处理组，分别为无调节对照组(CK)、发酵过程碱调节组(T1)、发酵初始添加沸石组(T2)和发酵过程添加沸石组(T3)。每个处理组设3个平行处理，详见表2。其中CK组厌氧发酵全程不进行任何干预；T1组在消化液pH初次降至6.50时(发酵开始第3天)，以1 mol/L NaOH溶液将pH调节至7.50；T2组在厌氧发酵开始前添加5.0%的沸石(W/W)；T3组在消化液pH初次降至6.50时(发酵开始第3天)添加5.0%的沸石(W/W)。

表2 试验设计 (g)

各处理组物料混合完毕后一次性装入发酵瓶，以高纯N2向发酵瓶顶部空间吹入2 min；发酵瓶连同集气袋放入培养箱中孵育，每天振荡发酵瓶2次；试验周期内每天定时更换集气袋测定气体成分，每3天在密封状态下以针管抽取发酵液测定pH、VFAs等(试验开始的前6天每天检测pH)。

1.4 测定指标与方法

沼气产量:使用湿式气体流量计(TG1，Ritter，德国)测量。

沼气中甲烷含量:使用普析气相色谱仪(GC1100，普析，北京)测定。TDX－01色谱柱(3 m×3 mm，岛津，日本)，热导检测器，以高纯H2为载气，进样口、检测器温度分别设置为110、150℃；柱箱初始温度设为40℃，保持2 min，然后10℃/min程序升温至80℃并保持1 min。

发酵液pH值:使用pH计测定(PH－3C，雷磁，上海)。

TN、CP含量:使用凯氏定氮仪(Kjel Master K－375，BUCHI，瑞士)测定。

VFAs含量:指乙酸、丙酸、丁酸和戊酸含量之和，均采用岛津气相色谱仪(GC2014，岛津，日本)测定。DB－WAX色谱柱(30 m×0.32 mm，安捷伦，美国)，氢火焰检测器，进样口温度设定为250℃，检测器温度设定为300℃，以高纯N2为载气；色谱箱初始温度设为110℃并保持1 min，然后以10℃/min程序升温至250℃并保持5 min。

TC含量:使用总有机碳/有机氮分析仪(vario TOC，Elementar，德国)测定。

TS、VS含量:采用烘干失重法测定。

WSC、EE和CF含量:分别采用硫酸－蒽酮比色法、乙醚索氏抽提法和范氏洗涤纤维法测定。

1.5 数据处理与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2013和Origin 2018软件进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 沸石对厌氧发酵产沼气性能的影响

由图1可见，各处理组的沼气产生均呈现迅速升高后波段降低的变化特征，期间可出现多个产气高峰，这与发酵原料尾菜中糖类、蛋白质、纤维素等成分的微生物降解难易程度相关，同时也反映了产甲烷古菌对乙酸、H2等沼气发酵中间产物的利用效率不一。20%接种比中温发酵条件下，CK组最高日产气量仅为3.63 L/d(第6天)，显著低于其它各组，同时产气高峰数量也少于其它各组，反映了发酵体系酸化对产沼气效率的不良影响。各调节处理组最高日产气量为T1组在发酵第6天所达到的5.15 L/d，高于T2和T3处理组分别在第7天达到的5.05 L/d和4.18 L/d。这说明当pH迅速降低时，以NaOH直接进行调节可在短时间内迅速促进沼气产生；而T2组又显著高于T3组，可见发酵初始添加沸石相对于pH降低后再添加沸石，更有利于酸胁迫的缓解。

图1 厌氧发酵过程中日产沼气量变化

各处理组的累积产沼气量情况见图2，CK及T1、T2、T3各组累积产沼气量分别为39.28、46.57、66.36、53.13 L。相对于对照组，采取不同酸化调控措施的T1、T2和T3处理组累积产沼气量分别提升18.56%、68.94%和35.26%。用NaOH对发酵pH进行一次性调节，虽然能够短时间内迅速提高沼气产量，但随时间延续产气衰减较快，并不能从根本上改变发酵酸化对沼气微生物群落的不利影响。同时有研究指出为调节pH而引入的大量Na＋也不利于CH4产生[8]。沸石疏松多孔的结构可为微生物提供优良的附着基底，在发酵开始时即添加沸石可以促进微生物与沸石的有效结合，提高微生物对不良环境的抗逆性，进而提高发酵产沼气性能。而在环境已经酸化的情况下再使用沸石，已经受到“损伤”的沼气微生物群落恢复较慢，因而T3处理组的累积产沼气量显著低于T2处理组；但随着沸石加入后微生物群落逐渐稳定，酸胁迫影响逐渐减弱，因此发酵后期(15天之后)T3处理组的产气量反而较高。

图2 厌氧发酵累积产气量

2.2 沸石对厌氧发酵产甲烷特性的影响

沼气中CH4浓度的高低是评价厌氧发酵质量的重要指标，同时也能反映发酵体系的健康程度。CH4浓度高的沼气不但有利于后续燃烧、提纯、发电等，而且节省气体存储空间，是厌氧发酵追求的重要目标。如图3所示，各处理组厌氧发酵所产沼气中CH4含量在30 d试验周期内均呈快速升高后逐渐降低的变化趋势。其中CK组发酵过程中CH4含量最高仅能达到33.66%，且多数时间段内低于20%，所产沼气利用价值较低；而分别采取不同调节措施的T1、T2和T3处理组最高CH4含量分别可达64.88%、66.62%和65.14%，且除发酵开始和结束阶段外，CH4含量均高于40%。值得注意的是发酵起始阶段虽然各处理组产气量很高，迅速达到第一个产气高峰，但CH4含量却非常低，此时气体主要为蔬菜细胞呼吸作用、微生物有氧呼吸等过程产生的CO2、水蒸气等[9]。

图3 厌氧发酵过程中甲烷含量变化

如图4所示，发酵周期内CH4日产量变化情况与沼气日产量变化趋势(图1)接近，不同的是各处理组CH4日产量在试验开始的前3天均较低(＜0.1 L/d)，进一步说明了此时尚处于产CH4的延滞期。最高CH4日产量反映了不同处理条件下微生物群落的最高CH4产生效率，T1、T2和T3处理组最高CH4日产量分别比CK组高109.02%、163.93%、72.13%，可见本研究所采取的不同酸化调控措施均能大幅提高CH4产生效率，而又以发酵初始添加沸石的效果最佳。试验周期内CH4总产生量反映了系统在不同处理条件下的CH4产生潜力。本研究中，CK组累积CH4产量为5.24 L，而T1、T2和T3处理组累积CH4产量则分别为19.48、33.32 L和23.46 L，分别较CK提升271.76%、535.88%和347.71%。这进一步说明了添加沸石尤其发酵初始即添加可缓解尾菜厌氧发酵系统酸化抑制、强化CH4产能。

图4 厌氧发酵过程中甲烷日产量变化

2.3 沸石对发酵过程中pH值的影响

厌氧沼气发酵是由具有不同功能定位的微生物群体协同进行的复杂过程，梭菌、产甲烷古菌等重要功能微生物均需要在接近中性的环境中完成大分子降解、VFAs转化、产CH4等生理生化进程。然而由于发酵初期可溶性糖等大分子物质迅速分解、产甲烷古菌代谢效率偏低等因素，导致VFAs的生成和转化速率可能存在较大差距，从而使乙酸、丙酸等在环境中大量累积、不能及时转化，pH迅速降低而出现酸化现象。有研究指出，产甲烷古菌生长的最适pH范围为6.5～8.2，当pH低于5.0时其活性将被完全抑制[10]。

如图5所示，不采取任何酸碱调控措施时，发酵液pH在发酵开始后迅速下降，第3天时即低于6.5，第6天时达到最低点5.31，其后随着VFAs的逐渐消耗和氨氮等碱性物质产生，pH虽有所回升但始终低于6.5，说明此条件下发酵系统虽仍可维持一定的产CH4能力，但显然远离最佳运行状态。而当pH低于6.5时，用NaOH溶液迅速调节至7.5，虽然可以暂时阻止系统酸化，但是随着发酵的持续进行，系统pH仍持续下降并在第15天后低于6.5，说明单次NaOH酸碱调节不足以阻止发酵系统酸化的趋势。当pH低于6.5时再加入沸石，发酵液pH仍继续下降至5.51，其后再逐渐回升并在发酵后期稳定于7.0以上，相对NaOH酸碱调节，发酵过程中加入沸石虽不能迅速升高pH，但效果更持续、温和。在发酵初始即加入沸石抑制酸化的效果最好，系统pH虽然在第4天时达到6.33的最低点，但其后即迅速升至6.5以上并逐渐恢复至中性范围。可见，沸石的加入尤其发酵初始即加入，可为微生物提供疏松多孔的“庇护所”和反应界面，帮助其缓解酸胁迫，从而促进有机酸产消平衡和CH4形成。

图5 厌氧发酵过程中pH变化

2.4 沸石对发酵过程中有机酸浓度的影响

厌氧沼气发酵过程中，糖类等大分子水解生成VFAs是反应能够顺利进行的前提条件。但浓度过高的VFAs除引起环境pH迅速降低外，也可能对产甲烷古菌造成直接毒害，其中尤以丙酸的抑制作用最为显著。在农牧业有机废弃物厌氧发酵中，丙酸往往较早产生且更易累积，有研究认为当体系中丙酸浓度超过1 000 mg/L时，产甲烷古菌的生理代谢即会受到明显抑制，进而严重影响CH4的生成[11，12]。如图6所示，各处理组丙酸浓度均在发酵开始后迅速上升，且均在第6天时超过1 000 mg/L，其中CK组丙酸浓度始终维持在1 500 mg/L以上，而其它各组则在达到高点后逐渐降低；至30天反应结束时，CK及T1、T2、T3各处理组丙酸浓度分别为1 502.32、940.81、198.22、507.87 mg/L。综合产气情况来看，NaOH和沸石调节均能在一定程度上缓解丙酸对厌氧发酵微生物菌群的毒害，促进在反应初期大量生成的丙酸向乙酸等其它VFAs转化，有利于CH4的正常产生，而又以发酵初始即加入沸石的调控效果最佳。

图6 厌氧发酵过程中丙酸含量变化

发酵过程中总VFAs的变化如图7所示，除CK组外，各处理组VFAs浓度均呈升高后逐渐降低的变化趋势，与Demirel[12]、刘荣厚等[13]的研究结果类似。CK组VFAs浓度在达到3 716.55 mg/L的最高点后下降幅度较小，说明系统发生了较为严重的酸抑制现象，产甲烷古菌等微生物难以利用乙酸等生成CH4，而VFAs不能被有效消耗进一步形成负反馈，也抑制了产酸菌进一步产酸。而采取不同调控措施的T1、T2和T3组VFAs浓度最高分别可达4 330.09、4 864.49、4 583.78 mg/L，均远高于CK组，但之后均大幅降低，至发酵30天时均远低于CK。可见系统中VFAs短时的高量产生并不一定导致酸抑制发生。水解菌、产氢及乙酸菌和产甲烷古菌等微生物种群协调生长、代谢及VFAs的迅速利用是健康产气的重要保证，而沸石的加入对沼气微生物具有更为明显的保护作用。

图7 厌氧发酵过程中VFAs含量变化

3 讨论与结论

厌氧发酵是尾菜资源化利用的重要方式[14]，可同步实现沼气能源和沼渣、沼液有机肥料的产出。然而当以尾菜为主要原料进行厌氧发酵时，由于尾菜极佳的可生化性，发酵体系内的有机物分解菌快速代谢，短时间内即可产生大量有机酸，造成pH迅速降低，无法形成分解菌—产甲烷菌及大分子有机物—有机酸—甲烷的动态平衡，导致系统产沼气/甲烷效率严重下降，形成酸抑制。及时发现和预警包括酸抑制在内的发酵抑制因素，事关厌氧发酵的成败，已成为沼气工程领域研究和实践的重要内容。同时，采取不同措施确保厌氧发酵稳定进行对于尾菜资源的高效利用也是十分必要的。Serrano[15]和Shen[16]等将畜禽粪污、生活垃圾等与蔬果废弃物混合发酵，并增加多相发酵段，起到调节物料碳氮比、减小短时间内有机负荷冲击的作用，变相降低了发酵物料的可生化性和维护了发酵菌群的稳定，促进了沼气/甲烷的稳定产出。罗艳等[17]以不同浓度的NaOH溶液调控受酸抑制严重影响的互花米草中温厌氧发酵，不但有效避免了酸抑制现象，而且提高原料产气率达80%以上，表明NaOH溶液的间歇处理，能有效提高互花米草厌氧发酵的沼气产率。Li等[18]则通过适量添加Fe、Co、Ni等微量元素，提高体系内微生物群抗逆性，促进高OLR[3.5 g VS/(L·d)]情况下尾菜厌氧发酵体系的稳定。可见，高有机酸条件下，始终要以发酵菌群的稳定为厌氧发酵体系稳定的必要前提条件。

作为一种疏松多孔的矿物，沸石兼具热稳定性好、耐酸碱腐蚀等优点，各类天然和人工改造沸石已广泛应用在化学化工、生物工程、污水处理、异味气体治理等领域。作为微生物的良好载体，沸石能够显著提高多种细菌、微藻等微生物的丰度和抗逆性，并为生化反应提供更大的接触面积，显著促进硝化、反硝化、氨氧化等重要生化反应的进行，从而大幅提高原有菌群体系的效能[19]。沸石在有机废弃物好氧和厌氧处理方面也多有应用。魏宗强等[20]通过在鸡粪高温堆肥中添加沸石，有效降低了磷、钾养分的流失，并降低堆肥期间对地下水质的影响，提高鸡粪肥料化利用的经济性和生态性；李国光等[21]使用不同天然沸石和改性沸石吸附城市有机废弃物厌氧发酵沼液中的氨氮，发现NaCl改性沸石比表面积、孔径均有所增大，吸附效果最佳；冯洋洋等[22]以沸石配合碱液处理初沉污泥，有效降低了发酵液中对发酵有抑制作用的氨态氮浓度，提高厌氧发酵产沼气性能。

本研究将沸石应用于缓解尾菜厌氧发酵的酸抑制，通过对比自然发酵、碱中和、沸石加入时机等不同处理结果，得出如下结论。

(1)尾菜厌氧发酵易受酸抑制影响而不能正常进行。本研究20%接种比的中温厌氧发酵条件下，若不采取任何酸化调控措施，尾菜发酵液pH最低可降至5.31且难以恢复至中性范围，超过产甲烷古菌等关键沼气微生物的耐受阈值，进而导致发酵停滞。

(2)挥发性脂肪酸是关系到CH4产生效率的重要中间产物，短时高浓度的挥发性脂肪酸并不一定造成酸抑制，其生成和消耗的动态平衡是系统正常运转的重要保障。其中，高浓度丙酸对产甲烷古菌等沼气微生物种群毒性更强，其浓度与维持时间可作为监控尾菜厌氧发酵是否出现酸抑制的关键标志之一。

(3)沸石或NaOH调控均可一定程度上避免丙酸的高浓度累积，促进挥发性脂肪酸转化，从而缓解尾菜厌氧发酵过程中的酸抑制。相对无调节对照组，出现酸化倾向后用NaOH调节、发酵初始添加沸石与出现酸化倾向后添加沸石，可使累积产沼气量分别提升18.56%、68.94%和35.26%，累积产甲烷量分别提高271.76%、535.88%和347.71%，且以发酵初始即添加沸石效果更优。