巨藻Lessonia nigrescens岩藻多糖对烟草幼苗低温胁迫的缓解效应

邹平，杨霞，云龙，龚鹏飞，丁朋辉，周家新，杜秀春，杨伟，徐海波，李义强，曹亚凡

(1.中国农业科学院烟草研究所，山东 青岛 266101；2.陕西省烟草公司延安市公司，陕西 延安 716000；3.华环国际烟草有限公司，安徽 滁州 233121；4.山东青岛烟草有限公司，山东 青岛 266000；5.上海烟草集团有限责任公司，上海 200082)

生物刺激素能够促进植物营养吸收、提高植物抗逆性及抗病性，提高作物品质，可有效缓解植物逆境胁迫损害[1]。考虑到作物遭受极端温度、干旱和土壤盐渍化影响的普遍性，生物刺激素在农业生产中对作物产量与品质的贡献和作用越来越大。目前，植物生物刺激素主要包含海藻提取物、腐植酸、蛋白水解物与氨基酸、壳聚糖及其衍生物和微生物菌剂等种类[2]。其中，海藻提取物是一类重要的生物刺激素。岩藻聚糖是来源于褐藻的水溶性多糖，是一类结构复杂的海洋硫酸多糖，主要由岩藻糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸组成，另外含有较低比例的木糖、葡萄糖和氨基葡萄糖等，并具有独特的硫酸化L－岩藻糖结构[3]。不同褐藻来源岩藻聚糖的单糖组成不同，其岩藻糖含量从20%到90%不等，硫酸根含量差别也较大，从10%到40%不等[4]。岩藻聚糖因其独特的结构特征而具有多种生理活性，目前多用于医药和食品行业。近年来，岩藻聚糖在农业上的应用也越来越受到重视，如在果实保鲜方面，岩藻聚糖能够通过抑制酪氨酸酶来抑制鲜果褐变[5－7]。有研究提取了两种不同褐藻的岩藻聚糖，发现它们能够通过提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性以及增加酚类物质含量来增强椰枣的抗病性[8]。本实验室前期研究发现，岩藻多糖能够增强小麦耐盐性[9]。

在烟草生产过程中，尤其是育苗期及移栽后，经常会遭受“倒春寒”带来的低温冷害，导致烟苗生长缓慢，叶片黄化，移栽后不能快发，还可导致早花现象，影响烟叶生产。低温胁迫影响烟草幼苗光合作用和生理代谢，导致植株萎蔫甚至死亡。温度还能影响烟草中的结构与非结构性碳水化合物含量，从而影响烟叶品质[10]。因此，提高烟草幼苗对低温胁迫的抗性是烟草生产中急需解决的问题。已有研究报道，外源褪黑素[11]、水杨酸[12]、甜菜碱[13]均能够提高植株抗氧化酶活性，缓解低温造成的氧化损伤。本试验针对烟草幼苗易受冷害影响的实际问题，研究4℃低温胁迫条件下不同浓度岩藻多糖处理对烟草幼苗的影响，以期为烟草苗期种植和管理提供理论依据，同时细化和推进海藻提取物的农业应用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烟草品种为雪茄烟H382，属于低温敏感品种，由中国农业科学院烟草研究所提供。本实验室从巨藻Lessonia nigrescens中提取纯化得到岩藻多糖(LNP)，其分子量为45.4 kDa，单糖组成及比例为甘露糖0.24、葡萄糖醛酸0.22、岩藻糖0.21、半乳糖0.13、木糖0.13、葡萄糖0.05，硫酸根含量36.3%[9]。

1.2 试验设计及方法

试验设5个处理，分别为对照(CK):烟苗25℃培养箱正常培养；低温处理(CS):烟苗4℃培养箱培养；CS＋T1、CS＋T2、CS＋T3处理:烟苗分别喷施100、500、1 000 mg/L LNP溶液24 h后，置于4℃培养箱培养。3个重复，每重复10盆。

播种育苗前将烟草种子用次氯酸钠溶液消毒并冲洗干净。待烟苗长到4叶时，挑选生长良好且一致的幼苗进行移栽，置于光照培养箱中培养。光照培养箱条件为:光照周期14/10 h(昼/夜)，温度25/20℃(昼/夜)，光照强度800 μmol/(m·s)，相对湿度(65±5)%。待幼苗长出第6片叶时，按试验设计分组处理，并分别于处理后24、48、72 h进行取样。将样叶用液氮速冻，于－80℃条件下保存备用。

1.3 测定指标及方法

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 19.0软件的Duncan’s多重比较法对数据进行分析，采用OriginPro 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 LNP对低温胁迫下烟草幼苗叶片产生速率和H2O2含量的影响

由图1A看出，低温胁迫24 h后，烟草幼苗叶片中H2O2快速积累，低温胁迫处理组是对照组的2.05倍；随着时间推移，低温胁迫48 h和72 h后，低温胁迫组H2O2含量分别是对照组的2.58倍和2.53倍。喷施不同浓度的LNP溶液能够显著降低烟草幼苗叶片中H2O2含量。低温胁迫24 h，100、500、1 000 mg/L LNP处理组H2O2含量较低温胁迫组分别下降7.0%、13.4%和12.8%；低温胁迫48 h和72 h，不同浓度LNP处理组H2O2含量较低温胁迫组分别下降15.7%、28.8%、29.2%和11.1%、32.6%、31.5%。

图1 不同浓度LNP处理对低温胁迫下烟草幼苗叶片H2O2含量和产生速率的影响

可见，不同浓度LNP均能够减少低温胁迫导致的烟草幼苗体内活性氧积累，从而减轻对植株的氧化损伤。但500 mg/L和1 000 mg/L LNP处理组之间无显著差异。

2.2 LNP对低温胁迫下烟草幼苗MDA和脯氨酸含量的影响

由图2A可见，低温胁迫处理后，烟苗叶片的MDA含量显著增加，低温处理24、48、72 h，MDA含量分别是对照组的1.47、1.63、1.67倍。喷施不同浓度LNP后，烟草叶片MDA含量明显减少，低温处理24 h后，100、500、1 000 mg/L LNP处理组MDA含量较低温胁迫组分别下降12.4%、25.7%、24.9%；低温处理48 h和72 h，不同浓度LNP处理组MDA含量较低温胁迫组分别下降11.1%、33.0%、31.8%和13.0%、34.1%、34.5%。表明LNP能够显著缓解低温胁迫对烟草幼苗质膜的氧化损伤，且喷施500 mg/L LNP效果最好。

由图2B可见，低温处理24、48、72 h，脯氨酸含量分别比对照组高36.9%、84.8%、48.2%。不同浓度LNP处理可以明显促进烟草叶片脯氨酸的积累。低温处理24 h，100、500、1 000 mg/L LNP处理组脯氨酸含量较低温处理组分别增加10.5%、23.7%、21.9%；低温处理48 h和72 h，分别增加2.4%、22.5%、35.3%和3.6%、35.3%、33.3%，其中，100 mg/L LNP处理组与低温胁迫处理的烟苗脯氨酸含量无显著差异；1 000 mg/L LNP处理组脯氨酸含量略低于500 mg/L LNP处理组，但二者无显著差异。

图2 不同浓度LNP处理对低温胁迫下烟草幼苗叶片MDA和脯氨酸含量的影响

2.3 LNP对低温胁迫下烟草幼苗叶片渗透调节物质的影响

在逆境胁迫下，植物通过积累渗透调节物质如可溶性糖及和可溶性蛋白来降低细胞渗透势，维持细胞内水分平衡。由图3可见，低温处理24、48 h，烟草叶片可溶性糖含量均是对照组的1.13倍；低温处理72 h，其含量略低于对照组，但无显著性差异。不同浓度LNP处理后烟草叶片可溶性糖含量明显增加。低温处理24 h，100、500、1 000 mg/L LNP处理组可溶性糖含量较低温处理组分别增加2.7%、18.6%、17.8%；低温处理48 h和72 h，分别增加5.8%、17.9%、20.0%和15.9%、48.0%、47.6%。

图3 不同浓度LNP处理对低温胁迫下烟草幼苗叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响

低温胁迫下，烟草叶片可溶性蛋白含量与可溶性糖含量具有相似的变化趋势，均随处理时间的延长先升高后降低。不同浓度LNP处理均提高了烟草幼苗体内可溶性蛋白含量，且500、1 000mg/L LNP处理组显著高于100 mg/L LNP处理组。

2.4 LNP对低温胁迫下烟草幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

由图4看出，低温胁迫24、48 h，烟苗叶片SOD活性分别是对照组的1.30、1.26倍，POD活性分别是对照组的1.13、1.26倍，CAT活性分别是对照组的1.45、1.53倍，APX活性分别是对照组的1.24、1.33倍。低温胁迫72 h，SOD、POD、CAT及APX活性均有一定程度的降低，其中SOD活性显著低于对照组，而POD、CAT及APX活性与对照组无显著性差异。喷施不同浓度LNP可以明显增强烟叶SOD、POD、CAT及APX活性。低温胁迫24 h，与低温处理组相比，100、500、1 000 mg/L LNP处理组SOD活性分别提高29.8%、35.5%、34.5%，POD活性分别提高10.7%、29.9%、22.9%，CAT活性分别提高7.8%、14.6%、15.2%，APX活性分别提高26.0%、50.4%、46.8%。低温胁迫48 h和72 h，与低温处理组相比，不同浓度LNP处理组的SOD活性分别提高14.3%、38.3%、35.6%和22.3%、72.6%、74.9%，POD活性分别提高6.6%、40.4%、31.5%和35.3%、81.2%、80.9%，CAT活性分别提高4.3%、19.6%、20.0%和52.7%、104.2%、105.6%，APX活性分别提高12.5%、32.5%、33.8%和26.8%、50.3%、47.2%。综上说明，LNP处理能够增强烟苗叶片抗氧化酶活力，从而降低低温对植株的氧化损害。

图4 不同浓度LNP处理对低温胁迫下烟草幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

3 讨论与结论

低温胁迫能够促进植物体内活性氧(ROS)的产生，导致膜脂过氧化，并能够导致水分失衡，从而影响植物新陈代谢，致使植物萎蔫甚至死亡。植物通过调节渗透平衡和增强体内抗氧化酶活性来抵抗低温胁迫的不利影响。海藻及其废弃物产量巨大，在传统农业中，简单工艺发酵的海藻提取物一直被当作有机肥料使用；而近年来的研究发现，海藻提取物还能够发挥生物刺激素的功效，提高植物的抗逆性[15]。研究发现，来源于泡叶藻Ascophyllum nodosum的海藻提取物能够增强作物对营养物质的吸收，促进作物生长[16，17]，提高农产品的质量[18]，且能够提高植物抵抗干旱[19]、高温[20]等逆境胁迫的能力。

但海藻提取物成分复杂，无法确认其发挥作用的活性物质。目前，针对海藻提取物的研发更倾向于从混合物向单一物质发展，其中，利用海藻中丰富的海藻多糖资源制备生物刺激素具有良好的应用前景。褐藻酸主要存在于褐藻细胞壁中，是由甘露糖醛酸(M)和古罗糖醛酸(G)经过1，4－键合形成的线型多糖。但褐藻酸分子量大，难溶于水，在农业应用中，需要通过酶降解或者化学降解将其降解成低聚糖，利于植物吸收利用。如研究发现酶解低聚褐藻酸能够通过激活SA途径和积累具有抗病原活性的次生代谢物来增强植物的防御反应[21]。低聚海藻酸盐能够通过调节细胞渗透势、提高抗氧化活性等提高植物对干旱胁迫[22]、盐胁迫[23]等逆境胁迫的耐受性。

当植株受到低温等逆境胁迫时，植物细胞膜透性增大，结构稳定性下降，膜功能受到影响，最终引起细胞代谢障碍[24]。低温胁迫下植物可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加，是植物对低温胁迫的一种应激反应，另外，脯氨酸也可以进行渗透调节并稳定细胞膜结构[25]。对低温胁迫下的烟草进行转录组和代谢组研究表明，低温处理后烟草氮代谢和糖代谢能力增加，细胞内游离氨基酸及可溶性糖积累，维持了细胞渗透势，增强了烟草抗低温能力[26]。本研究中，短时间(24、48 h)低温胁迫下，烟草体内渗透调节物质明显增多，这是植株对于低温胁迫的应激反应；当低温胁迫72 h后，其含量下降，这是由于低温阻碍了渗透调节物质合成与代谢。LNP处理后，烟草体内渗透调节物质含量明显升高，有助于降低细胞渗透势，维持水分平衡，从而减少了低温对植株的伤害。研究发现，褐藻寡糖[27]、水杨酸[12]等均能够增加低温处理后烟苗植株中脯氨酸积累，减少低温导致的渗透胁迫，增强烟苗抗低温能力。

正常生理条件下，ROS积累是植物代谢的必然结果，但在非生物胁迫下过度的ROS积累导致氧化损伤，抑制关键代谢酶，诱导细胞死亡。受到胁迫的植物维持活性氧的动态平衡依赖于抗氧化酶系统。本研究中，4℃低温处理后，烟草植株中产生速率、H2O2含量以及MDA含量均明显增加，是由于细胞膜遭受低温导致的氧化伤害。低温处理24 h及48 h，烟草幼苗体内的SOD、POD和CAT活性均显著提高；低温处理72 h，各酶活均明显下降，低于对照组。研究证明在非生物胁迫下，小麦植株通过增强SOD、CAT、POD和APX等抗氧化酶活性来减轻氧化损伤[28]。不同研究中抗氧化酶的响应趋势不同，可能是由于抗氧化酶在低温处理的不同时间段呈现动态变化。短时间低温胁迫下，如本研究的48 h内，低温激发了植物自身的免疫反应，诱导植物提高自身抗氧化酶活性来抵御低温胁迫。在低温处理时间较长的研究中[12，29]，植株体内酶活力下降，阻碍了正常生理代谢。另外，除了低温处理的时间、温度不同，不同的植物种类响应低温的方式和路径也可能不同。施用LNP后，烟草幼苗体内产生速率、H2O2含量以及MDA含量均显著下降，抗氧化酶活性均显著高于低温胁迫组；虽然处理72 h亦有所下降，但仍显著高于低温胁迫组。说明施用外源LNP可以提高烟苗抗氧化酶活性，增强对活性氧的清除能力，降低低温对植株的伤害。

海藻多糖浓度对作物的影响不同，Liu等[30]发现蜈蚣藻Grateloupia filicina多糖浓度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)对水稻幼苗的发芽参数有显著影响，0.1 mg/mL蜈蚣藻多糖显著提高了水稻幼苗的根长和活力指数。柠条Caragana korshinskii种子萌发参数与蓝藻多糖浓度相关，发芽率最高的多糖浓度为60 mg/L，而活力指数最高的多糖浓度为10 mg/L[31]。以上两项研究中，多糖的种类、类型、浓度均不同，但都表明低浓度多糖能够提高植物种子活力。本研究中，低浓度100 mg/L LNP对低温胁迫烟苗缓解作用不大，500、1 000 mg/L LNP能够显著提高烟苗抗低温能力，但二者之间无显著性差异。这些最佳浓度之间的差异可能是由于多糖的来源不同、植物品种和所处生长阶段不同造成的。

总之，喷施岩藻多糖能够增强低温胁迫下烟苗抗氧化活性，降低氧化伤害，提高植株体内渗透调节能力，提高植株耐低温能力。本研究中，500、1 000 mg/L LNP能够显著提高烟苗抗低温能力，考虑到成本及效果，500 mg/L LNP是最优选择。为了加强海藻多糖类生物刺激素在农业中的应用，其提高植物耐低温能力的分子机制及对不同品种的普适性还有待进一步研究。