抗氧化活性最佳佛手酵素正交法优化制备

邱 迁，廖 芸，孟 琦，周 锋，阎怡平，张 华，2

（1.重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404120；2.重庆市渝东北特色生物资源开发利用工程技术研究中心，重庆 404120）

佛手属于芸香科柑橘属植物[1]，是一种药食同源植物，其花、叶、果均可入药，具有疏肝理气、和胃止痛的作用[2]。食品方面可加工成佛手蜜饯、佛手茶和佛手酒等。佛手主要功能成分包括挥发油、多糖、氨基酸、黄酮类化合物、香橼脂类等化合物[3-5]。酵素是一种以水果、蔬菜为原材料，利用酵母菌、乳酸菌及其他益生菌发酵而形成的一种液体或固体食物，所含营养成分非常较多，包括脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶等，具有抗炎、抗菌、抗氧化、增强免疫力、降脂、解酒、保肝、美白及改善肠道微环境的功能[6-8]。由于其天然特性和无副作用而受到人们的广泛追捧。目前，佛手主要通过售卖佛手果和盆景来获得一定的经济效益。与国外相比，我国佛手果深加工产品较少[9]。因此，试验以佛手为原材料，通过优化试验条件，以羟基自由基清除率为考查指标，研究具有羟基自由基活性最佳佛手酵素制备工艺，为佛手的进一步深加工和开发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 样本与主要试剂

野生新鲜成熟佛手果，外表金黄、皱而有光泽、购自自重庆市万州区龙沙镇。

无水乙醇、七水硫酸亚铁、30%过氧化氢溶液，中国重庆川东化工集团有限公司提供；水杨酸，成都市科龙化工试剂厂提供；无水葡萄糖，购自当地药店；果胶酶，山东圣斯德食品添加剂有限公司提供；安琪活性干酵母，安琪酵母（伊犁）有限公司提供；红棉纯正红糖，广州市华侨糖厂提供；水为超纯水，实验室自制。

1.2 主要仪器

722型可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司产品；FA1004型号电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；HH.S型精密恒温水浴锅，江苏金坛市医疗仪器厂产品；低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；FW80型高速试样粉碎机，河北省黄市新兴电器厂产品；ZXFD-5250型十段编程鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司产品；AIphal1-2 LDplus型真空冷冻干燥机，德国Christ公司产品。

2 试验方法

2.1 样品预处理

将新鲜佛手果切成薄片，置于60℃恒温干燥箱中干燥4 d，粉碎后过40目筛，密封干燥保存。

2.2 酵母菌的活化

准确称安琪活性干酵母粉5 g加入质量分数为2%的葡萄糖溶液50 mL，于30℃条件下进行活化3~5 h。

2.3 酵素制备

2.3.1 工艺流程

佛手液的制备（佛手干粉1 g∶蒸馏水20 mL）→添加果胶酶反应→煮沸糖化→灭菌→接种酵母菌→离心取上清液→真空冷冻干燥。

2.3.2 操作要点

准确称取5 g过40目筛的佛手果干粉，加入蒸馏水,料液比为1∶20（g∶mL），之后加入果胶酶0.21 g，作用15 min后，煮沸糖化1.5 h，加入不同量的红糖，摇匀，然后放入灭菌锅，在115℃条件下灭菌30 min。灭菌冷却后在无菌环境下按不同接种量接种已活化的安琪高活性干酵母，放入恒温箱中进行发酵[10]。发酵后获得酵素液，并通过测定羟基自由基的活性作为评价酵素功能的检测指标。

2.4 单因素试验

2.4.1 酵母菌接种量的确定

设定糖质量分数20%，发酵时间36 h，发酵温度30℃，分别考查不同酵母接种量（体积分数）2%，4%，6%，8%，10%所得酵素的羟基自由基清除率。

2.4.2 糖质量分数的确定

设定发酵时间36 h，发酵温度30℃，酵母接种量2%，分别考查不同糖质量分数（质量分数）10%，15%，20%，25%，30%所得酵素的羟基自由基的清除率。

2.4.3 发酵时间的确定

设定糖质量分数20%，发酵温度30℃，酵母接种量2%，分别考查不同发酵时间36，60，84，108，132 h所得酵素的羟基自由基清除率。

2.4.4 发酵温度的确定

设定糖质量分数20%，发酵时间36 h，酵母接种量2%，分别考查不同发酵温度26，28，30，32，34℃所得酵素的羟基自由基清除率。

2.5 正交试验

在酵母菌接种量（A）、糖质量分数（B）、发酵时间（C）、发酵温度（D）4个单因素基础上进行L9（34）正交试验，设计四因素三水平试验，取3个考查水平，分别以发酵时间36，60，84 h和糖质量分数10%，15%，20%，酵母菌接种量4%，6%，8%和发酵温度28，30，32℃对比试验。以所得酵素的羟基自由基的清除率为评价指标，确定酵母菌发酵的最佳工艺条件，每一次试验称取佛手干粉为5 g。

正交试验的因素与水平设计见表1。

表1 正交试验的因素与水平设计

2.6 测定羟基自由基的清除率

2.6.1 试剂配制

（1）9 mmol/L乙醇-水杨酸。精确称取水杨酸1.243 g，然后用乙醇溶解，将溶解液移入100 mL容量瓶中用乙醇定容，然后取出部分在另一容量瓶中稀释10倍。

（2）9 mmol/L硫酸亚铁。精确称取FeSO4·7H2O溶液2.502 g，加入蒸馏水溶解，将溶解液移入100 mL容量瓶中定容，然后取出部分在10 mL另一容量瓶中稀释10倍。

（3）8.8 mmol/L H2O2。精确称取30%的H2O2溶液9.926 g在小烧杯中，加入蒸馏水，然后移入100 mL容量瓶中定容，然后取1 mL置于另一100 mL容量瓶中稀释100倍。

2.6.2 试验方法

取出一支10 mL试管，依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL和9 mmol/L水杨酸溶液1 mL，再加入稀释后的佛手酵素液1 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL。充分摇晃均匀后，置于37℃热水中水浴反应30 min，取出冷却，然后充分摇晃，于510 nm波长处测定其吸光度为A1，此为试验组，不加样品为空白组测得的数值为A，不加H2O2的为对照组，测得的数值为A0[11]。

式中：A——空白对照的吸光度；

A1——加样品的吸光度；

A0——不加显色剂H2O2。

2.7 真空冷冻干燥

将发酵液可溶性固形物质量分数浓缩到30%，通过真空冷冻干燥得到水分质量分数小于5%的佛手果渣酵素粉。真空冷冻干燥条件为冷冻温度-20℃，真空度10~20 Pa，冷阱温度-45℃[12]。

2.8 数据统计与分析

每组试验设置3个重复，数据用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，差异显著者进行Ducan's多重比较。结果用“平均值±标准差”表示，显著水平设置为p=0.05。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 不同酵母菌接种量对佛手酵素液羟基自由基清除率的影响

酵母菌接种量与酵素羟基自由基清除率关系见图1。

图1 酵母菌接种量与酵素羟基自由基清除率关系

由图1可知，酵母菌接种量为6%时，所获得的羟基自由基清除率最大，最高可达到43.79%。达到最高清除自由基能力之后，随着接种量的增加，羟基自由基清除能力逐渐降低。

3.1.2 不同糖质量分数对佛手酵素液羟基自由基清除率的影响

糖质量分数与酵素羟基自由基清除率关系见图2。

由图2可知，当糖质量分数为15%时有一个峰值，在糖质量分数为25%时一个最低值，之后随着糖质量分数升高，又有上升趋势。总体清除自由基能力差别为27%~29%，差别较小。考虑成本等因素，认为当糖质量分数为15%时为最佳。其他研究也表明，怀山药酵素液SOD活性随着糖质量分数的增加先升高再降低，糖质量分数为12%时SOD活性最高[13]。

图2 糖质量分数与酵素羟基自由基清除率关系

3.1.3 不同发酵时间对佛手酵素液羟基自由基清除率的影响

发酵时间与酵素羟基自由基清除率关系见图3。

图3 发酵时间与酵素羟基自由基清除率关系

由图3可知，最佳发酵时间为108 h，此时对羟基自由基的清除率最大，为28.34%。其次为60 h和132 h，羟基自由基清除率为23.27%和22.86%。分析原因可能是发酵菌在发酵过程中产生了一些诸如SOD等抗氧化酶类清除活性氧。另一方面可能是酵菌本身就具有一定的抗氧化能力。例如，有研究发现酵母菌的细胞壁多糖能够清除羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）等活性氧，起到抗氧化的功效[10]。但是随着发酵时间增多，发酵原料物质的消耗殆尽，便开始呈现下降或是平稳趋势[14]。考虑到试验效率，选取60 h为最佳发酵时间。

3.1.4 不同发酵温度对佛手酵素液羟基自由基清除率的影响

发酵温度与酵素羟基自由基清除率关系见图4。

图4 发酵温度与酵素羟基自由基清除率关系

由图4可知，发酵温度与酵素羟基自由基清除率关系研究结果表明，最佳发酵温度为30℃，羟基自由基清除率最高达到34.4%，是最低值的1.36倍。可能是此时的温度是适合生存酵母菌的最佳温度，有利于酵素的形成，酵素的含量增高[13]。

3.2 正交试验

正交试验见表2，L9（34）正交试验结果方差分析见表3。

表2 正交试验

表3 L9（34）正交试验结果方差分析

通过表2可以判断出各因素对试验结果的影响的主次关系并确定最佳工艺提取条件。4个因素的极差顺序为RD＞RC＞RA＞RB，说明发酵温度对制备酵素对羟基自由基清除率的影响最大，酵母菌接种量次之，发酵时间再次之，糖质量分数对其影响最小。根据总和的比较，发酵时间K2＞K3＞K1，糖质量分数K3＞K2＞K1，酵 母 菌 接 种 量K3＞K2＞K1，发 酵 温 度K1＞K2＞K3得 到 的 制 备 佛 手 酵 素 的 最 优 方 案 为A2B3C3D1，即发酵时间为60 h，糖质量分数为20%，酵母菌接种量为8%，发酵温度为28℃时，对羟基自由基的清除率为26.33%±8.20%。

由表3可知，发酵温度对佛手酵素羟基自由基清除率的影响差异极显著，发酵时间和发酵温度影响差异显著。

3.3 验证试验

在分析正交试验结果后，以得出的最佳提取工艺基础上进行验证试验，在最佳提取工艺条件下，即发酵时间60 h，糖质量分数20%，酵母菌接种量8%，发酵温度28℃时平行试验3次，测定酵素液的羟基自由基活性，结果表明，26.25%±2.99%与正交最优组合26.33%±8.20%基本一致。所以综合以上因素，A2B3C3D1提取工艺条件较为理想，结果稳定、合理。

3.4 佛手酵素制备

试验最后将最佳工艺所获得成品浓缩至30%后，经真空冷冻干燥后保存于-80℃冰箱中[12]。

4 结论

以佛手果为试验对象，依据羟基自由基抗氧化活性强弱制备酵素，分别考查了酵母菌接种量、发酵时间、糖质量分数、发酵温度4个单因素，并进行了正交试验优化。试验表明佛手酵素具备羟基自由基清除能力，查阅文献未见佛手酵素相关研究，但是与其他药食同源食品酵素类似，具有ABTS和DPPH自由基清除能力[15]。试验选出的最佳发酵时间为60 h，与已有报道相符。在不同的原料、菌种，不同的的发酵工艺及目标产物显示酵素发酵的时间存在较大差异。例如，王俊伟等人[16]研究糙米发酵只需2 h，就可以产生γ-氨基丁酸含量较高的酵素。李豆[17]在新型水果酵素的研制过程中，发酵时间为1~3个月。郭伟峰等人[18]研制桑葚酵素饮料发酵所需时间24 h，SOD酶活力明显提高。总体而言，最终选出抗氧化活性最佳的佛手酵素发酵工艺的最佳因素为发酵时间60 h，糖质量分数20%，酵母菌接种量8%，发酵温度28℃。同时，将得到的发酵液灭菌浓缩后通过真空冷冻干燥，制成佛手果渣酵素粉状产品。