响应面法优化克氏原螯虾虾头酶解工艺研究

燕瑜翰，卢静静

（1.武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北 武汉 430205；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212023）

0 引言

克氏原螯虾因其味道鲜美、蛋白质含量丰富、营养价值高、烹饪方式多样，受到广大消费者的青睐。在克氏原螯虾加工和消费过程中，产生了大量的虾头、虾壳等副产废弃物，目前常见的处理方法是将虾头等废弃物粉碎后与鱼粉混合加工饲料，但其附加值较低[1]。

虾头富含蛋白质、脂肪酸及风味物质，作为副产废弃物之一，其回收加工再利用研究备受关注，以虾头为原料加工开发水产调味品，成为目前的研究热点。解万翠等人[2]以南美白对虾虾头酶解蛋白粉为原料，加工开发得到虾味浓郁的虾风味料。任艳艳等人[3]以中国对虾虾头为原料，利用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶进行复合酶解，对酶解液进行处理，得到香味浓郁的虾调味料。郑捷等人[4]采用风味蛋白酶和碱性蛋白酶复合酶法对虾下脚料进行酶解，以酶解液为原料处理后，进行调配，得到香味浓郁、虾味鲜美的复合调味料。另外，汤丹剑等人[5]、徐坤华等人[6]分别以哈氏仿对虾虾头、中华管鞭虾虾头为原料，进行研究，制备虾味调味料。但关于克氏原螯虾虾头利用的研究报道较少，因此试验以克氏原螯虾虾头为原料，利用碱性蛋白酶进行水解，并对酶解工艺进行了优化，为虾头副产物综合利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

克氏原螯虾虾头，购自农贸市场；碱性蛋白酶，安徽天悦生物科技有限公司提供；水合茚三酮、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

AL104型分析天平、722型可见分光光度计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；TG-16WS型高速离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司产品；UV-2800型紫外分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 克氏原螯虾虾头酶解条件优化

虾头解冻后洗净，加水粉碎磨浆，取虾头浆于锥形瓶中，按料液比（1∶0.5，1∶1.0，1∶2.0，1∶3.0，1∶4.0）加水混匀，调溶液pH值为（6.0，7.0，8.0，9.0，10.0），加入碱性蛋白酶（500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 U/g），在适当的温度下（40，50，60，70，80℃），酶解（2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h）后，沸水浴10 min灭酶，然后以转速4 500 r/min离心10 min，取上清液测游离氨基酸含量，计算水解度，研究酶解条件对酶解效果的影响[1]。在单因素试验基础上，应用Design Expert软件设计响应面试验，以水解度为响应值进行优化。

1.3.2 酶解液水解度测定

（1）游离氨基酸含量测定[7]。采用茚三酮比色法，准确吸取200 μg/mL的异亮氨酸标准溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加水定容至4.0 mL，加入缓冲溶液1 mL，混匀后水浴加热15 min，冷却至室温，定容摇匀。静置15 min，于波长570 nm处测吸光度，绘制标准曲线Y=0.001 1X+0.075 1。

（2）蛋白质含量的测定参考凯氏定氮法GB 5009.5—2016。

2 结果与分析

2.1 底物料液比对虾头酶解效果的影响

料液比对虾头酶解效果的影响见图1。

图1 料液比对虾头酶解效果的影响

由图1可知，随着体系溶剂量的增大，底物浓度逐渐减小，虾头水解度先上升后下降，在料液比为1∶1（g∶mL）时，体系水解度达到最大，随后水解度开始下降，可能是由于底物浓度降低，不利于碱性蛋白酶与蛋白质的结合[8]，因此当料液比为1∶1时酶解效果最好。

2.2 酶用量对虾头酶解效果的影响

酶用量对虾头酶解效果的影响见图2。

图2 酶用量对虾头酶解效果的影响

由图2可知，随着碱性蛋白酶用量的增大，水解度呈现先增大后趋于稳定的趋势。酶用量由500 U/g增大至1 500 U/g，底物水解度由8.74%升高至20.44%，达到最大值，可能是在一定范围内，随着酶用量的增大，酶浓度增加，酶与底物蛋白的结合位点逐渐增多，酶解效果不断增强，达到一定浓度，酶与蛋白的结合位点达到饱和，水解度达到最大，而后继续增加酶用量，但由于底物浓度固定，水解度基本保持稳定，酶解效果变化不大。因此酶用量为2 000 U/g时，虾头酶解效果最好。

2.3 酶解pH值对虾头酶解效果的影响

酶解pH值对虾头酶解效果的影响见图3。

图3 酶解pH值对虾头酶解效果的影响

由图3可知，随着pH值的增大，水解度呈先升高后下降的趋势，当pH值由6.0增至9.0，底物水解度由5.55%增至22.3%，继续增大pH值至10.0，水解度开始下降。原因在于酶的活性受pH值的影响，在酶最适pH值时酶的活性最大，此时酶解效果最好，试验所用碱性蛋白酶的最适pH值可能是9.0，此时体系内生成的游离氨基氮含量最大，水解度最高。所以，当初始pH值为9.0时，酶解效果最好。

2.4 酶解时间对虾头酶解效果的影响

酶解时间对虾头酶解效果的影响见图4。

由图4可知，随着酶解时间由2 h增加至3 h，虾头水解度显著增加，由9.63%增至22.57%，但反应至3 h后，水解度基本趋于平稳，不再有显著变化。可能是由于酶与底物结合需要一定的时间，随着反应时间的延长，底物与酶活性位点逐渐结合，酶解程度逐渐增大，当底物蛋白与酶活性位点完全结合时，水解度增至最大，继续延长反应时间，无多余的酶活位点参与反应，水解程度不再增加。因此，当酶解3 h时，酶解效果最好。

图4 酶解时间对虾头酶解效果的影响

2.5 酶解温度对虾头酶解效果的影响

酶解温度对虾头酶解效果的影响见图5。

图5 酶解温度对虾头酶解效果的影响

由图5可知，随着酶解温度的升高，水解度呈先增大后减小的趋势，60℃时，水解度最大。可能由于随着温度的升高，酶活性逐渐增大，加速酶与蛋白质之间的酶解反应速率，达到酶最适温度60℃时，酶活最大，酶解效果最好，体系水解度最大，继续升温，温度过高会抑制蛋白酶的活性甚至失活，影响酶解反应的速率，导致水解度降低。因此，当酶解温度为60℃时，酶解效果最好。

2.6 响应面优化虾头酶解试验

响应面设计方案及分析结果见表1，方差分析结果见表2。

表1 响应面设计方案及分析结果

由表2可知，模型p＜0.000 1表明回归方程达到极显著水平；相关系数R2=0.937 6，校正决定系数R2Adj=0.952 5，说明该模型可靠，可用于克氏原螯虾虾头酶解条件的分析和预测。

表2 方差分析结果

通过对二次多元回归模型进行优化处理，得到最优酶解条件为料液比1∶1.2，初始pH值8.92，酶解时间3.11 h，酶解温度60.66℃，得到酶解液水解度为24.89%。为验证该条件的可靠性，重复3次进行试验，得到酶解液水解度为25.31%，与理论值的相对误差为1.7%，说明该模型与实际情况拟合较好，结果可靠。

3 结论

以克氏原鳌虾虾头为原料，采用碱性蛋白酶酶解制备酶解液，通过单因素试验及响应面法确定最佳酶解条件为碱性蛋白酶添加量2 000 U/g，料液比1∶1.2，初始pH值8.92，酶解时间3.11 h，温度60.66℃，该条件下水解度25.31%。