不同乳酸菌对发酵桑葚汁酚类物质含量及抗氧化能力的影响

孙百虎

（石家庄职业技术学院 食品与药品工程系，河北 石家庄 050081）

桑葚（Morus albaL.）又名桑果、桑葚子、桑枣，为桑科落叶乔木桑树的成熟果实，广泛种植于亚洲、欧洲、北美洲等区域[1]。桑葚在传统中医药行业发挥着极其重要的作用，常被用于发烧、咳嗽、哮喘、高血压等疾病的治疗及预防[2]。桑葚果实艳丽，果肉酸甜可口且含有丰富的营养物质，是鲜食果类中的佳品。桑葚富含功能活性物质，其中花青素类，酚酸类及黄酮类物质含量丰富。相关研究表明，桑葚提取物具有较强的抗氧化能力，并且能够显著抑制癌细胞生长，具有一定的抗癌功效[3]。经常食用桑葚能够改善机体免疫，降低血压血脂，具有良好的保健功效[2]。

乳酸发酵是已知的维持和提高水果营养品质的最古老、经济、安全的生物技术方法[4]，诸多研究证明，果蔬经乳酸发酵后其营养品质大大改善，并且具有良好的风味[5]。相关文献表明乳酸菌产品能够降低血清胆固醇水平，改善肠胃功能，增强免疫系统[6]。苏能能等[7]利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵桑葚汁，结果表明经乳酸菌发酵后桑葚汁抑菌活性明显提高；杜延兵等[8]将桑葚汁与牛奶复配后进行乳酸发酵，提高了桑葚汁营养风味，得到一种风味独特的营养产品。此外相关研究也报道了利用嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌发酵桑葚汁促进了其花青素的转化，大大提高了酚酸类物质的含量[9]。

基于其丰富的活性成分含量，世界各国将其作为保健功能食品进行加工销售，桑葚采摘后贮藏期较短，食品加工行业经常将其干制或将其榨汁发酵以提高其附加值，延长其贮藏期。虽然果蔬发酵相关研究较多，但不同菌种对桑葚汁的理化性质、营养成分含量及抗氧化能力的影响研究较少。四种乳酸菌：嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）（ST）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）（LB）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（LP）、干酪乳杆菌（Lacbobacillus casei）（LC）常用于果蔬的乳酸发酵，因此本试验选用此四种不同乳酸菌菌种发酵桑葚汁，探究其活菌数、总糖及还原糖及酚类物质含量及变化，并采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法及铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）比较其抗氧化能力。为更好的选择优良发酵菌种，提高桑葚加工潜力提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与菌株

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）（ST）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）（LB）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（LP）、干酪乳杆菌（Lacbobacillus casei）（LC）：中国工业微生物种保藏中心。

桑葚（品种为台湾72C002）：2021年2月采自广东河源市桑葚采摘园，果实采摘完毕后迅速带回实验室利用榨汁机榨汁，果汁过滤后备用。

1.1.2 试剂

福林酚、磷酸氢二钾、甲醇、碳酸钠、三氯化铝、磷酸二氢钾、3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；没食子酸、绿原酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、对香豆酸、芦丁、槲皮素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）、矢车菊素-3-O-芸香糖苷（cyanidin-3-rutinoside，C3R）、抗坏血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水溶性维生素E（Trolox）（均为色谱纯）：上海源叶股份科技有限公司。

1.1.3 培养基

MRS肉汤培养基：10.0%蛋白胨，8.0%牛肉粉，4.0%酵母粉，20.0%葡萄糖，2.0%磷酸氢二钾，2.0%柠檬酸氢二铵，5.0%乙酸钠，0.2%硫酸镁，0.04%硫酸锰，1.0%吐温80。120 ℃高压灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

MJ-WBL2531H榨汁机：美的集团；SPX-250B-Z生化培养箱、YXQ-LS-5OS型立式蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HH-S6双列六孔型电热水浴锅：北京科伟有限公司；1525型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国Waters公司；UV-mini1240型紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；CM-600D色差计：美国亨特利公司；SB-500DTY型超声波扫频清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种接种及发酵

将ST、LB、LP、LC四种菌种置于灭菌后的MRS肉汤培养基进行活化复壮（37 ℃条件下培养36 h），37 ℃静置12 h后，以0.5%的比例接种于桑葚汁中于37 ℃下静置发酵36 h。

1.3.2 活菌数测定

发酵过程桑葚汁中活菌数测定参考ROBERTS D等[10]的方法：取1 mL发酵液使用生理盐水稀释至108～1014倍，取0.1 mL稀释液接种至MRS培养基中，并在37 ℃下培养36 h[10]，记录菌落数为lg（CFU/mL）。

1.3.3 总糖、还原糖含量的测定

利用3,5-二硝基水杨酸法和苯酚-硫酸法分别对桑葚汁中总糖、还原糖含量进行测定。

1.3.4 总酚、总黄酮、总花青素含量测定

利用福林酚比色法测定桑葚汁中的总酚含量[11]：125 μL不同质量浓度的没食子酸标准溶液（0～600.0 μg/mL）或桑葚汁加入125 μL福林酚试剂静置6 min后加入1.25 mL 7%碳酸钠溶液，后加入3.5 mL蒸馏水，混合溶液在室温下静置90 min后利用紫外分光光度计于波长760 nm条件下测量溶液吸光度值。以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到标准曲线回归方程为：y=2.494 0x+0.022 3，相关系数R2=0.998。按照标准曲线回归方程计算发酵桑葚汁中总酚含量，结果表示为mg没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）/mL。

桑葚汁中总黄酮类物质的测定参考刘丙花等[12]方法：取2 mL芦丁标准液（0、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L和60 mg/L）或桑葚汁加入0.75 mL 5%硝酸钠溶液混合5 min后添加0.5 mL 10%硝酸铝溶液。混匀静置6 min后，加入4 mL 5%氢氧化钠，混合后将溶液定容至25 mL，利用紫外分光光度计在波长510nm处测量吸光度值。以芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得到标准曲线回归方程为：y=2.328 8x-0.025 4，相关系数R2=0.997。按照标准曲线回归方程计算发酵桑葚汁中总黄酮含量，结果表示为mg 芦丁当量（rutin equivalent，RE）/g（以干基计）。

桑葚汁中总花青素含量的测定采用pH示差法在波长510 nm和700 nm处使用紫外-可见分光光度计测定发酵桑葚汁中花色苷含量，结果表示为mg C3G/mL。花色苷含量计算公式如下：

式中：TAC为花青素含量，mg C3G/mL；A为吸光度值；MW是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分子量（449.2 g/mol）；DF为稀释因子；ε是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷摩尔吸收率（ε=26 900）。

1.3.5 单体酚类物质含量的测定

桑葚汁中单体酚类物质的测定采用HPLC法[13]。使用C18色谱柱（4.6 mm×150 mm），检测温度28 ℃，流动相：1%甲酸（A相），乙腈（B相）；洗脱程序：0～5 min（5%B），5～25 min（12%B），25～40 min（30%B），40～50 min（45%B），50～60 min（5%B）。酚酸类物质，黄酮类物质，花青素类物质分别在波长260 nm、320 nm及520 nm处测定。使用外标法通过与保留时间进行对比对酚类物质进行定性分析，通过峰面积与含量关系进行定量分析。

1.3.6 抗氧化能力测定

DPPH自由基清除能力的测定参考LI T L等[14]的方法：将1 mL样品加入2 mL DPPH甲醇溶液（45 mg/L），后避光反应30 min。用紫外-可见分光光度计在波长517 nm处测量吸光度值。结果以DPPH自由基抑制率（%）表示，其计算公式如下：

式中：Ac为2 mL无水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度值；Ai为2 mL桑汁待测液加2 mL DPPH溶液的吸光度值；Aj为2 mL桑汁待测液加2 mL无水乙醇的吸光度值。

铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）的测定参考GAO Q H等[15]的方法：将1 mL桑葚汁或抗坏血酸标准溶液（0、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25 μg/mL、30μg/mL）与2mL0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）混合后加入及2 mL 1%铁氰化钾溶液。将混合物50 ℃水浴20 min，然后添加2 mL 10%三氯乙酸。将2 mL反应溶液与2 mL混合蒸馏水和0.4 mL0.1%氯化铁溶液混合。使混合物在黑暗中反应30 min，并通过紫外-可见分光光度计在波长700 nm处读取吸光度值。以抗坏血酸溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制抗坏血酸溶液标准曲线，得到标准曲线回归方程为：y=0.418 9x+0.03，相关系数R2=0.998。并按照标准曲线回归方程计算铁离子还原能力。FRAP结果表示为mg抗坏血酸当量（ascorbic acid equivalent，AAE）/mL。

1.3.7 数据分析

数据结果以3个独立实验的“平均值±标准差”表示。使用SPSS18.0进行数据分析。利用邓肯氏检验分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。所得数据之间的相关性采用标准皮尔逊相关性分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌活菌数在桑葚汁发酵过程中的变化

益生菌的生长及其活力对于发酵产品的质量和稳定性至关重要，不同乳酸菌发酵桑葚汁发酵过程活菌数的变化见图1。由图1可知，四种乳酸菌皆在12 h内快速生长，其生长速率最快，随后其生长速率放缓，四种乳酸菌发酵完毕后，其中接种菌株LP桑葚汁中活菌数最高，达到了12.5 lg（CFU/mL），其次是接种菌株LC的桑葚汁（活菌数为12.2 lg（CFU/mL）），接种ST的桑葚汁中活菌数最少为11.5 lg（CFU/mL）。结果表明，菌株LP能够更好的利用桑葚汁中的各类营养物质，该结果与李依娜等[16]的结论一致。

图1 桑葚汁发酵过程中不同乳酸菌活菌数的变化Fig.1 Changes of viable counts of different lactic acid bacteria during mulberry juice fermentation

2.2 总糖及还原糖含量变化

微生物在发酵过程中消耗糖类物质用于自身代谢活动。不同菌种发酵桑葚汁中总糖及还原糖含量见图2。

图2 桑葚汁发酵过程中还原糖（a）及总糖（b）含量的变化Fig.2 Changes of reducing sugar (a) and total sugar (b) contents during mulberry juice fermentation

由图2可知，未发酵桑葚汁中含有最高的总糖及还原糖含量，总糖含量为180.4 mg/L，还原糖含量为110.4 mg/L。桑葚汁经不同菌种发酵后其总糖与还原糖含量皆呈现显著降低（P＜0.05），与其他三种菌株相比，菌株LP对桑葚汁中总糖及还原糖的影响最大，发酵结束后其总糖含量降低了28.9%，还原糖含量降低了27.3%。这表明菌株LP相较于其他菌株可以消耗更多的糖类物质，发酵过程中糖类物质的减少与其转化为乳酸及植物乳杆菌的新陈代谢、增长生殖有关[17]。这也解释了为何接种菌株LP的桑葚汁中活菌数更高。

2.3 总酚、总黄酮及总花青素含量变化

众多研究表明桑葚中富含酚酸、黄酮及花青素类物质[18]。不同乳酸菌发酵桑葚汁发酵过程中总酚，总黄酮及总花青素含量见图3。由图3可知，不同乳酸菌发酵结束后总酚含量皆有显著性提高（P＜0.05），特别是菌株LP发酵桑葚汁中检测到最高的总酚含量为9.3 mg/mL，其次是菌株LC与LB，菌株ST发酵桑葚汁中总酚含量最低为7.4 mg/mL。主要原因是乳酸菌菌株可以释放水解酶类将复杂的结合酚类物质水解为单体酚类物质[19]。不同乳酸菌发酵桑葚汁中总黄酮含量随发酵时间呈现先上升后下降趋势，不同乳酸菌皆在发酵24 h桑葚汁中具有最高的总黄酮含量，可能的原因是发酵初期结合态酚类物质在水解酶的作用下溶出，导致游离黄酮类含量提高，后期随着花青素类物质的逐步降解而产生含量下降趋势[14]，发酵结束后（36 h），菌株LP发酵桑葚汁中总黄酮含量为4.5 mg/mL，其次是菌株ST与LC，菌株LB发酵桑葚汁中的总黄酮含量最低。与LI T L等[14]研究结果一致，主要原因为乳酸菌菌株释放酚类物质氧化酶解聚高分子酚类物质。近年来越来越多的研究表明摄入桑葚中的花青素可以有效减少心血管疾病、2型糖尿病及神经功能下降等诸多疾病的发病率[18]。由图3可知，不同乳酸菌发酵桑葚汁中总花青素含量随发酵时间呈现下降趋势，主要原因为乳酸菌发酵过程产生的酶类，促进了花青素类物质的解聚[18]。发酵结束时（36 h），不同乳酸菌发酵桑葚汁中总花青素含量差异较大，其含量范围为1.5～1.88 mg/mL，菌株LP发酵桑葚汁中总花青素含量为1.5 mg/mL；菌株LB与LC发酵桑葚汁中总花青素含量相同为1.88 mg/mL；菌株ST发酵桑葚汁中总花青素含量为1.7 mg/mL。结果表明，菌株LP能释放更多的水解酶类物质。

图3 桑葚汁发酵过程中总酚（a），总黄酮（b）及总花青素（c）含量变化Fig.3 Changes of total phenols (a),total flavonoids (b) and total anthocyanins (c) contents during mulberry juice fermentation

2.4 单体酚类物质含量变化

酚类物质是桑葚中重要的具有极强抗氧化活性的一类次级代谢产物。以未发酵桑葚汁作为对照，不同乳酸菌发酵前后桑葚汁中酚类物质含量见表1。

表1 不同乳酸菌发酵桑葚汁酚类物质发酵前后含量变化Table 1 Changes of phenolics contents in mulberry juice before and after fermentation by different lactic acid bacteria

由表1可知，共检测出10种单体酚类物质，包括6种酚酸类物质，2种黄酮类物质，2种花青素类物质。花青素类物质是桑葚中重要的酚类物质，相关研究表明，桑葚中具有较高的C3G，并且C3G是桑葚中最主要的花青素类物质[18]，这也与本研究结果一致，未发酵桑葚汁中C3G的含量为286.03 mg/L。此外花青素类物质在经不同菌种发酵后其含量明显下降（下降了18.3%～30.0%），这也与LI Z X等[23]研究结果一致。

绿原酸及咖啡酸含量在桑葚汁中含量较高，是最主要的酚酸类物质，在未经发酵的桑葚汁中其含量分别为148.05 mg/L、110.07 mg/L。桑葚汁经不同乳酸菌发酵后其绿原酸及咖啡酸含量有所提高，主要原因为乳酸菌释放的水解酶类水解转化复杂高分子酚类物质，如花青素等物质，生成了绿原酸及咖啡酸，促进了酚类物质的转化[20-21]，结果也与C3G与C3R含量在发酵过程中含量下降对应。桑葚汁在经菌株LP发酵后其绿原酸的含量最高，达到了201.6 mg/L。较未发酵前提高了36.2%。菌株ST发酵桑葚汁的绿原酸含量最低为152.50 mg/L，菌株LB发酵后桑葚汁的咖啡酸含量最低为120.60 mg/L。益生菌发酵促进了桑葚汁中花青素类物质的生物转化，并且产生绿原酸及咖啡酸，使其在桑葚汁中的含量明显升高。

此外，未发酵桑葚汁还检测出了较高含量的对羟基苯甲酸，并且经不同乳酸菌发酵后其含量无显著性差异（P＜0.05）。槲皮素是桑葚汁中最主要的黄酮类物质其含量达到了86.88 mg/L，这也与KWAW E等[22]研究结果一致。经不同乳酸菌发酵后槲皮素含量均存在明显上升趋势。槲皮素在经菌株LP发酵后桑葚汁中其含量最高（121.30 mg/L），较未发酵对照组升高了39.6%。

2.5 抗氧化能力

桑葚果汁中高含量的活性物质如酚类物质等能够清除自由基及阻断自由基链式反应而到达抗氧化的效果[24]。以未发酵桑葚汁作为对照，不同乳酸菌发酵前后桑葚汁DPPH自由基清除能力与FRAP见图4。由图4可知，未经发酵桑葚汁的DPPH自由基清除率与FRAP最低，分别为65.3%及25.3 mg AAE/mL。桑葚汁经不同乳酸菌发酵后其DPPH自由基清除能力与FRAP皆呈现显著升高趋势，此外，酚类化合物自由形式的增加以及乳酸发酵产生的其他副产品可能是提高抗氧化能力的原因[11，25]，其中经菌株LP发酵的桑葚汁其DPPH自由基清除能力与FRAP最高，分别为80.5%、38.5 mg AAE/mL。这是由于菌株LP发酵桑葚汁能够产生更高含量的游离酚类物质，使其具有更高的抗氧化能力。

图4 不同乳酸菌发酵桑葚汁前后DPPH自由基清除率与FRAP值的变化Fig.4 Changes of DPPH radical scavenging rate and FRAP value of mulberry juice before and after fermentation by different lactic acid bacteria

3 结论

本研究比较了干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌发酵对桑葚汁糖类（总糖及还原糖）、酚类物质含量及抗氧化能力的影响。结果表明，不同乳酸菌发酵桑葚汁发酵结束其活菌数存在较大差异，植物乳杆菌发酵桑葚汁中活菌数最高达到了12.5 lg（CFU/mL），经不同乳酸菌发酵后桑葚汁中总糖及还原糖含量有所下降，总酚、总黄酮含量显著提高，并且植物乳杆菌发酵桑葚汁中总酚、总黄酮含量最高（总酚含量为9.3 mg/mL，总黄酮含量为4.5 mg/mL），此外乳酸菌发酵促进了花青素类物质的转化。对发酵前后桑葚汁中10种酚类物质检测结果得知桑葚汁经不同乳酸菌发酵后其绿原酸及咖啡酸含量有所提高，C3G含量有所下降。植物乳杆菌发酵桑葚汁的DPPH自由基清除能力最强为65.3%，FRAP铁离子还原力最强为25.3 mg AAE/mL。综上，植物乳杆菌发酵性能最佳，发酵桑葚汁后总酚及总黄酮含量最高，抗氧化能力最强，可作为桑葚汁乳酸发酵的最佳菌种。