鱼露中挥发性成分的形成及影响因素分析

林 威，章文贤，2，黄祖新，2，蒋咏梅，2*

（1.福建师范大学 生命科学学院，福建 福州 350117；2.福建省传统酿酒行业技术开发基地，福建 福州 350117）

鱼露又称鱼酱油，风味独特，营养丰富，含有必需氨基酸、牛磺酸、维生素、微量元素等[1]，是中国沿海和东南亚等地区常见的调味品。鱼露的历史悠久，曾记载于2 200多年前的《周礼》和1 400多年前贾思勰的《齐民要术》中，19世纪后期，希腊南部和意大利也开始鱼露的生产[2]。传统鱼露的制作方法通常是以鳀鱼、沙丁鱼等低值海鱼为原料，添加大量盐，在常温条件下发酵数月、甚至数年而成。发酵过程中，高浓度盐使发酵体系的渗透压提高，抑制了绝大多数霉腐微生物的生长，在原料鱼内源酶与耐盐微生物的双重作用下，鱼肉中的蛋白质和脂肪被水解利用，最终形成体态澄清、口味醇厚、风味突出的成品鱼露[3-4]。

鱼露的风味主要由滋味与气味组成，滋味即非挥发性成分，主要包括氨基酸、短肽链、核苷酸和生物碱，它们可产生酸、甜、咸、鲜、苦五种基本味道，主要通过氨基酸组分分析和电子舌滋味分析。气味即指挥发性成分，是评价鱼露品质的重要指标[5]，主要包括醇、醛、酮、酸和酯类以及一定量的胺类化合物与腥味物质[6]。它们易于挥发，可刺激鼻腔神经感受到炙烤香、鱼腥味、奶酪香、肉香、黄油爆米花味等复杂风味，目前常采用气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）进行分析。本文对鱼露中主要挥发性成分的来源、种类及其形成的相关因素进行综述，为后期鱼露发酵工艺的改良和成品风味品质的提升提供参考。

1 鱼露中主要挥发性成分的来源和种类

鱼露中挥发性成分主要来源于原料中内源酶的作用和微生物的分解（图1）。在内源酶和微生物的协同作用下，鱼肉和内脏中的蛋白质和脂肪先被水解为游离氨基酸和游离脂肪酸等初级代谢产物，再经次级代谢产生各种具有挥发性成分的化合物。蛋白质经蛋白酶和氨肽酶分解而成的短肽和游离氨基酸，不仅呈现一定的滋味，也是挥发性物质的前体，在多种微生物酶的催化下，它们通过转氨、脱氨、脱羧等生成酸、醇、醛、酯和含硫化合物等特征风味物质，如异亮氨酸、缬氨酸可代谢生成有果香味、麦芽风味的3-甲基丁醛和2-甲基丁醛，天冬氨酸能分解产生黄油味的双乙酰，鸟氨酸和赖氨酸可经脱羧生成腐胺和尸胺等。由脂肪水解得到的游离脂肪酸通过自动氧化，以及还原、氧化或酯化反应生成醇、醛、酮、酸、酯类等代谢产物，饱和脂肪酸则可经不完全β-氧化生成甲基酮和内酯等重要风味物质[7]。研究发现，鱼露发酵过程中脂质的氧化与挥发性化合物的增加具有显著的相关性，亚油酸的氧化产物1-辛烯-3-醇以及醛类物质（己醛、庚醛、2-甲基丙醛等）的含量，在一定程度上可以反映鱼露发酵过程中脂肪酸的氧化程度，这说明鱼露中挥发性小分子风味物质的前体大多来源于脂肪的氧化代谢[8]。

图1 鱼露中挥发性成分的主要来源Fig.1 Main sources of volatile components in fish sauce

原料中的蛋白质和脂肪在内源酶和微生物分解的双重作用下，产生了错综复杂的挥发性产物，经GC-MS分析鉴定，它们大致可分为醇类、醛类、酮类、酯类、酸类、烷烃类、杂环化合物、含氮化合物和含硫化合物等类（表1）。由表1可见，不同产地的鱼露所含挥发性成分的种类有明显差异，导致鱼露呈现的风味也各有千秋。

表1 鱼露中的挥发性成分种类Table 1 Types of volatile components in fish sauce

大多数鱼露中，醇、酸、醛、酮、酯类是主要的挥发性成分，但其浓度高低并不一定能够反映鱼露的风味。这是因为不同化合物的嗅觉最低感受浓度（阈值）不同，阈值越低的化合物越容易被嗅觉器官感知[16]。醇类化合物中的不饱和醇阈值较低，对鱼露风味的贡献较大。醛类化合物来源于脂质氧化的降解产物，一般有草味、甜味、麦芽味和果香味等令人愉快的气味。酮类化合物与多不饱和脂肪酸和氨基酸的降解有关[17]，一般有醚味和奶酪味。酯类化合物主要来源于醇类和酸类物质的酯化反应，阈值较低，呈现果香味和花香味[18]。酸类化合物则来源于脂肪氧化和水解[19]，常带有汗味、腐败味等不愉快气味，但因其阈值较高，对风味的影响不大。含氮化合物有三甲胺和组胺、以及微量的吡嗪、吡啶等，它们常带有烧焦味和氨味。

随着技术不断完善，鱼露中检测到的挥发性物质也逐渐增多，但由于阈值的影响，众多挥发性化合物中仅有小部分化合物对鱼露的香气有贡献。王悦齐等[9]从发酵1～12个月的鱼露中检测到56种挥发性化合物，并以气味活度值（odor activity value，OAV）为评价指标，从中筛选到12种OAV＞1的主体呈香风味化合物，包括2种醇类，7种醛类，1种酯类和2种含氮化合物（表2），其中3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、2-甲基丙醛和乙酸乙酯，它们对鱼露的整体香气贡献最为显著，使鱼露呈现蘑菇味、土豆味、麦芽味、香草味、水果香味和鱼腥味。在诸多挥发性成分，尤其主体呈香化合物的综合作用下，不同来源的鱼露风味各异，如泰国鱼露有焦糊味、腥味、汗味、腐臭味和奶酪味[20]，韩国与泰国的市售鱼露有花香味、草香味、干酪味、杏仁味与汗臭味[10]，王炳华等[21]则以酒香、花香、果香、汗臭味、苦味和鱼腥味来描述鱼露的风味。

表2 鱼露发酵过程中的主体呈香化合物[9]Table 2 Main aroma compounds in fish sauce fermentation

2 鱼露中挥发性成分形成的影响因素

影响鱼露中挥发性成分形成的因素很多，以下主要从鱼露的发酵原料、制作工艺、微生物种类和发酵时间几方面加以介绍。

2.1 发酵原料

用于鱼露发酵的原料较多，产地不同，所用鱼的种类大多不同，如日本Shottsuru常采用沙丁鱼、柔鱼，泰国Nam-pla采用日本鳀和日本鲭，越南Chin Su采用凤尾鱼，中国香港除用沙丁鱼、日本鳀之外，也用丽叶鲹和褐蓝子鱼发酵制作鱼露[22]。广东潮汕一带则主要以鳀鱼，鲜鱼作为原料进行鱼露的制作，鱼种不同导致成品鱼露的口感和风味差别较大。陈丽丽等[11]对6种鱼露样品（原料分别为鳗鱼、凤尾鱼、草鱼鱼露、鳀鱼鱼露、鲜鱼鱼露和银鱼鱼露）的挥发性化合物进行全二维气相色谱-质谱（GC×GC-MS）检测，分别得到178、80、138、77、54和118种挥发性成分，其中，作为主要挥发性成分的醇类与醛类化合物，分别占六种鱼露挥发性产物的35.50%、24.71%、33.23%、24.59%、25.70%和39.76%，差异显著。

江津津等[23]以鳀鱼、蓝圆鲹、绿鳍马面鲀和丁香鱼（鳀鱼幼鱼）为原料用传统工艺制作鱼露，经GC-MS和电子鼻检测，发现蓝圆鯵鱼露中挥发性化合物最多，有17种，包括6种醛类，3种酸类，3种含硫化合物，这可能与蓝圆鲹中含有较高的蛋白质含量有关。除了鱼的种类，鱼的成熟度也对鱼露的风味有一定影响。与丁香鱼（鳀鱼幼鱼）相比，成熟的鳀鱼中蛋白质和脂肪含量较高[24]，因而产生的挥发性化合物也较多。

2.2 发酵工艺

采用不同的发酵工艺，得到的成品鱼露也有较大差别。目前鱼露的生产主要采用传统工艺和速酿工艺。传统工艺即天然发酵，是将原料鱼与盐按一定的比例混合，在自然条件下经前期腌制自溶、中期露天发酵和后期保温后熟三阶段，再进行勾兑、灭菌和成品包装的制作工艺[25]。传统发酵通常在高盐浓度下进行，高盐导致的高渗条件虽然抑制了大多数腐败微生物的生长，但同时也降低了水解酶的活性与其他微生物的繁殖速率，因而发酵周期较长。

与传统发酵相比，速酿工艺可明显缩短鱼露的生产周期，常通过保温、加酶、加曲和复合发酵等方式实现，但由于发酵时间短，存在成品风味变差和产生异味的风险[26]。保温工艺即将发酵过程维持在较高温度下，使内源酶迅速降解原料鱼中的蛋白质和脂肪从而提高生产效率。研究发现印度凤尾鱼在60 ℃保温时自溶活性最高，起主要作用的是胰蛋白酶[27]。高温发酵虽节省时间，但常导致成品颜色变浅，风味欠佳，先低温后高温的方式可以有效避免这种现象[28]。

加酶工艺即在发酵时添加外源蛋白酶或富含蛋白酶的鱼内脏，从而增强原料中蛋白质的水解速率，进而达到快速发酵的目的。加入少量富含蛋白酶的大西洋鳕鱼肠，可有效提高蛋白质的利用率和缩短鱼露的发酵时间[29]。RABIE M A等[30]以鲭鱼为原料，外加菠萝蛋白酶进行发酵，不仅缩短了鱼露的生产周期，成品的风味和营养价值均有明显提高。王正云等[31]以草鱼下脚料为原料，添加0.3%复合蛋白酶（中性蛋白酶∶风味蛋白酶=1∶1），50 ℃发酵，得到的鱼露口感咸鲜，入口滑爽，符合国家二级酱油标准。

加曲发酵首先需要培养曲种，通常以米曲霉为主，也可采用酱油曲[32]或酒曲[33]，这些曲块含有大量微生物及其分泌的复杂酶系，可以加快原料鱼中蛋白质和脂肪的水解速率，从而有效缩短发酵时间。在曲块中众多微生物和复杂酶系的作用下，原料鱼中的营养成分被分解转化为种类繁多的代谢产物，挥发性成分也往往较为多样，因而加曲发酵所得鱼露风味通常优于保温和加酶工艺。以草鱼下脚料为原料，添加含有米曲霉和黑曲霉的混合曲发酵，可得到风味独特的成品鱼露。刘鹏飞[34]采用GC-MS技术比较市售传统鱼露与外加曲发酵鱼露的挥发性成分，发现外加曲鱼露有26种，明显高于市售鱼露。然而，王炳华等[21]在比较传统发酵法、加曲发酵法和复合发酵法（前期加曲，后期添加乳酸乳球菌乳亚种（L.lactissubsp.lactis）和球形球拟酵母）三种工艺时，得到了不同的结果，发现传统发酵法制备的鱼露挥发性成分更多，且成品风味浓郁，品质上乘。可见鱼露的品质不仅取决于发酵工艺，还与原料种类、微生物种类和数量，以及发酵条件密切相关。

2.3 发酵微生物

鱼露发酵过程中，微生物的菌群结构，尤其优势菌的种类和数量对关键特征风味物质的形成起着决定作用。

黄紫燕等[35]采用菌落培养法，对传统鱼露发酵过程中微生物动态进行检测，发现发酵初期、中期和后期的优势菌群分别为霉菌、酵母菌和乳酸菌，且菌群结构的变化与各项理化指标及游离氨基酸的变化有着密切的关系。首先，霉菌分泌大量蛋白酶和脂肪酶，将鱼肉中的蛋白质和脂肪分别水解为多肽、氨基酸和脂肪酸。接着，盐渗入鱼体，鱼汁渗出，环境中渗透压显著提高，霉菌逐渐被乳酸菌和酵母菌代替，产生大量醇、酸、醛、酯等滋味和风味物质。

研究发现，环境中约99%的微生物无法用传统的纯培养方式培养。为更加全面深入地研究传统鱼露发酵过程中微生物群落的演替规律，李春生等[36]采用高通量测序技术对鱼露发酵样品菌群的基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）进行检测，发现随着发酵的进行，细菌的种类呈现先上升后下降的趋势，发酵6个月时，细菌种类可达到312种。由于是高盐环境，主要的发酵微生物大多属于嗜盐菌。发酵前期盐厌氧菌属（Halananaerobium）相对丰度最高，它与三甲胺和乙酸乙酯的形成分别呈正相关和负相关，可能通过抑制鱼露中水果香味的产生促进传统鱼露中鱼腥味的生成。发酵中后期，盐单胞菌属（Halomonas）成为优势菌群，它与2-甲基丙醛的形成呈正相关，可能与鱼露中麦芽香味的形成有关。

DU F等[37]也对中国传统鱼露的发酵微生物进行了高通量测序，发现盐厌氧菌属（Halanaerobium）、四联菌属（Tetragenococcus）、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）与游离氨基酸、可溶性总氮、三甲胺的产生有很高的相关性。其中盐厌氧菌属与假交替单胞菌属在三甲胺的形成过程中起促进作用，而四联菌属则起抑制作用。发酵初期，希瓦氏菌属（Shewanella）为优势菌群，占细菌总量的90%左右，发酵12个月后，希瓦氏菌属被盐厌氧菌属（Halanaerobium）取代。3月到9月乳酸杆菌（Lactobacillus）大量存在。发酵12～15个月，四联菌属（Tetragenococcus）成为鱼露中的主导细菌，后期假单胞菌（Pseudomonas）则大量出现。

2.4 发酵时间

传统鱼露发酵的时间较长，短则12～18个月，长则2～3年。通常，鱼露的发酵时间越长，原料鱼的蛋白质和脂肪被降解得越充分，产生的挥发性物质越多，风味也更加醇厚香浓。肖宏艳等[12]对传统发酵1年、2年、3年和3年后保温1周的潮汕鱼露中的挥发性成分进行分离与鉴定，发现发酵时间不同，鱼露中挥发性酸、醇、醛、酮和含氮、含硫化合物的相对含量变化明显。其中醛、酮和含氮化合物的含量随时间增加而增大，醇类则呈下降趋势。王悦齐等[9]对发酵时间为1个月、3个月、6个月、9个月和12个月的鱼露中的挥发性成分进行检测，发现除酮类变化不大之外，其他挥发性成分的数量及浓度均随发酵时间的延长有所增加，醛类和醇类化合物的总含量明显高于其他挥发性化合物，随发酵时间的延长，主体呈香风味化合物的OAV也普遍呈上升趋势。

2.5 其他影响因素

除原料、工艺、微生物和发酵时间之外，发酵温度和盐渍浓度也对成品鱼露的风味有较大影响。保温是速酿工艺之一，加曲和加酶发酵工艺也对温度有着明确的要求。将传统发酵2年的鱼露置于60 ℃条件保温8 d，挥发性成分有明显增加，风味物质的种类及含量与发酵3年的鱼露相当[38]。发酵盐浓度对鱼露中挥发性成分的形成也有显著影响，高盐浓度虽会延缓鱼露的发酵进程，但更有利于鱼露中乳酪味和肉香味气味的挥发性成分的产生[39]。

3 总结与展望

鱼露中的挥发性成分组成复杂，种类繁多，是发酵原料、制作工艺、微生物菌群结构和发酵时间等多种因素共同作用的结果。近年来，鱼露中挥发性成分逐渐受到科研工作者的重视，相关研究也明显增多，但仍存在一些不足之处。

（1）鱼露中挥发性产物的种类和数量尚不明确。尽管检测手段越来越先进，如气味指纹技术与气相色谱-人工嗅辨仪-质谱联用，但由于鱼露中挥发性成分种类繁多，检测结果往往重复性不佳，这也是后期研究的方向。

（2）挥发性成分的形成机制仍需探索。虽然目前已知其通常是以初级代谢产物为前体产生的小分子物质，但对于某种具体的挥发性产物，它的微生物来源，及其具体的代谢途径还需要进一步摸索。

（3）发酵工艺仍需改进。当前市售鱼露主要通过传统工艺制作，产品优质，但发酵周期过长。速酿工艺虽然有助于缩短发酵时间，但会影响挥发性成分的形成，导致成品的风味变差。因此有研究者先采用速酿工艺制作鱼露，再对其进行Maillard反应或外加L-丙氨酸[40]等产品进行后加工。考虑到鱼露中挥发性成分主要来源于微生物的发酵作用，也可以通过构建微生物菌群与鱼露发酵周期中的挥发性成分关系图谱，在鱼露制作过程中适时添加特定微生物，以调控发酵过程中挥发性成分的形成，从而提高鱼露的整体风味。

作为传统调味品，鱼露的风味是极为关键的判断依据。在众多构成和浓度各不相同的挥发性成分的综合作用下，成品鱼露才得以呈现浓醇鲜香的特征性风味。因此，深入探究鱼露特征挥发性风味化合物形成的机制及影响因素显得尤为重要，相关研究不仅有助于开拓发酵鱼露制作的新工艺，提升成品鱼露的品质，也可以为其他微生物发酵制品的风味研究提供参考。