芦笋皂苷调控circ_0001361/miR-136对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

程琳 张刚

结肠癌已成为一种常见的恶性肿瘤，每年导致大量与癌症相关的患者死亡[1]。由于结肠切除术、化学疗法和免疫疗法等治疗方法的改进，结肠癌患者总体5年相对生存率约为64%[2]。然而，晚期、转移性和复发性结肠癌患者的预后仍然很差。因此，迫切需要探索结肠癌进展的其他未知机制，并开发治疗新策略。芦笋是一种多年生植物，具有显著抗真菌、抗肝毒性、细胞毒性、抗诱变、抗炎和利尿特性[3]。芦笋富含多种生物活性植物化学物质，已被用于治疗各种慢性炎症疾病和癌症[4,5]。根据报道，从芦笋中提取的芦笋皂苷对癌细胞的细胞生长和运动具有潜在的抑制活性[6]。芦笋提取物对结肠癌具有良好的细胞毒性作用[7]。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类由上游剪接受体和下游剪接供体组成的环状RNA分子，在真核生物中广泛传播[8]。最近的研究揭示了circRNA充当微小RNA(MicroRNA，miRNA)海绵与包括结肠癌在内的多种人类恶性肿瘤的发生和进展相关[9]。在膀胱癌[10]、肝癌[11]中发现circ_0001361上调，它可能作为膀胱癌、肝癌治疗的靶点。本研究评估芦笋皂苷对结肠癌细胞增殖、凋亡及circ_0001361表达的影响，旨在探讨芦笋皂苷对结肠癌的抗癌功能与机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 结肠癌细胞SW1116(美国典型培养物保藏中心)，si-NC、si-circ_0001361、pcDNA、pcDNA-circ_0001361、miR-136模拟物、模拟物NC(miR-NC)(上海吉玛)，细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(日本Dojindo)，兔抗人B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗体、B兔抗人cl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗体(美国Abcam)，RIPA裂解缓冲液(江苏Beyotime)，膜联蛋白 V(Annexin V)-FITC凋亡检测试剂盒(美国Clontech Laboratories)，ECL蛋白质印迹检测试剂(美国GE Healthcare)，pmirGLO载体(美国Promega)，Trizol试剂(北京Solarbio)，特异性逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix(南京Vazyme)，乙醇、甲醇等试剂为国产分析纯。芦笋皂苷：新鲜芦笋(武汉新辰食品有限公司)于60℃烘干并粉碎成粉末，以1∶15的料液比加入74%乙醇，在50℃下超声提取54 min，过滤用旋转蒸发仪蒸干，以甲醇定容至100 ml备用[12]。

1.2 细胞培养 SW1116细胞在饱和湿润、5% CO2和37℃条件的培养箱内生长，培养基为含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)。

1.3 实验分组 将SW1116细胞分为对照组、芦笋皂苷L、M、H组、si-NC组、si-circ_0001361组、芦笋皂苷H+pcDNA组、芦笋皂苷H+pcDNA-circ_0001361组。对照组SW1116细胞未作任何处理，芦笋皂苷L、M、H组的芦笋皂苷浓度分别为45、90、180 mg/L[13]，作用时间为48 h。si-NC组、si-circ_0001361组、芦笋皂苷H+pcDNA组、芦笋皂苷H+pcDNA-circ_0001361组的SW1116细胞以1×105/孔的密度接种在6孔板中，培养汇合度至60%左右，根据Lipofectamine 2000试剂操作指示，分别进行si-NC、si-circ_0001361、pcDNA、pcDNA-circ_0001361转染。转染6 h后，根据分组将转染基质更换为不含或含180 mg/L芦笋皂苷的新鲜培养基，保持48 h。

1.4 CCK-8法检测细胞抑制率 将SW1116细胞(1×104个细胞)接种在96孔板中24 h。然后根据1.3 实验分组进行处理。向每个孔中加入10 μl CCK-8，持续2 h。使用酶标仪在每个孔中测定450 nm处的吸光度OD值，以(100%-实验组OD值)/对照组OD值×100%计算抑制率(%)。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 根据Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明指示，每组SW1116细胞(2×105个细胞)悬浮在结合缓冲液中，用Annexin V-FITC(5 μl)和碘化丙锭(propidium iodide，PI)(5 μl)在室温下黑暗中染色15 min。孵育后，在配备有CellQuest软件的Becton Dickinson FACScan流式细胞仪(激发波长为488 nm)中分析细胞。

1.6 克隆形成实验检测细胞克隆形成 将每组SW1116细胞接种在6孔板(500个细胞/孔)中，连续培养14 d，随后，细胞用4%多聚甲醛固定并用0.1%结晶紫染色。在显微镜下克隆数。

1.7 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达 在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中收集每组SW1116细胞总蛋白质。取20 μg蛋白经SDS-PAGE电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白封闭后，1∶1 000稀释的Bax、Bcl-2和GAPDH与膜在4℃下共培养过夜。与羊抗兔二抗在室温下共培养1 h。通过增强化学发光液可视化蛋白印迹。使用Image Lab软件量化Bax、Bcl-2相对于GAPDH的表达。

1.8 qRT-PCR检测circ_0001361和miR-136表达 使用Trizol试剂分离每组SW1116细胞RNA后，利用特异性逆转录试剂盒获得cDNA。然后，通过SYBR Green PCR Master Mix监测RNA水平，并使用2-ΔΔCt方法进行量化。以β-actin或U6作为内部对照。引物序列(5’-3’)为：circ_0001361-F CCCACTTGGTGAATGG AGAT，circ_0001361-R GGATTTGGTCGGTCATCATC。

β-actin-F TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC，β-actin-R ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG。miR-136-F ACACTC CAGCTGGGACTCCATTTGTTTT，miR-136-R CCAGTGC AGGGTCCGAGGT，U6-F CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-R AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.9 荧光素酶报告基因检测 miR-136与circ_0001361之间的结合位点通过软件Circular RNA Interactome预测。将含有miR-136预测或突变结合位点的circ_0001361序列插入pmirGLO载体，生成circ_0001361野生型(WT)或突变体(MUT)。将circ_0001361(WT/MUT)以及miR-136模拟物或miR-NC共转染SW1116细胞。在Dual-Lucy Assay系统中评估转染48 h后细胞的荧光素酶活性。另将pcDNA-circ_0001361、pcDNA转染SW1116细胞，48 h后以qRT-PCR评估miR-136表达。

2 结果

2.1 芦笋皂苷对SW1116增殖凋亡的影响 与对照组比较，芦笋皂苷L组、芦笋皂苷M组、芦笋皂苷H组SW1116细胞的抑制率、凋亡率逐渐增加，克隆数逐渐减少，Bax蛋白表达量递增，Bcl-2蛋白表达量递减(P<0.05)，且芦笋皂苷L组、M组、H组3组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表1。

表1 芦笋皂苷对SW1116增殖凋亡

2.2 芦笋皂苷对SW1116中circ_0001361和miR-136表达的影响 与对照组比较，芦笋皂苷L组、芦笋皂苷M组、芦笋皂苷H组SW1116细胞的circ_0001361表达量依次降低，miR-136表达量依次升高(P<0.05)，芦笋皂苷L组、芦笋皂苷M组、芦笋皂苷H组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 芦笋皂苷对SW1116中circ_0001361和miR-136表达

2.3 抑制circ_0001361对SW1116增殖凋亡的影响 抑制circ_0001361后，si-circ_0001361组SW1116细胞中circ_0001361的表达量比si-NC组减少0.77倍左右，细胞抑制率、凋亡率比si-NC组增加，克隆数、Bcl-2蛋白表达量较si-NC组降低，Bax蛋白表达量较si-NC组升高(均P<0.05)。见表3，图2。

表3 抑制circ_0001361对SW1116增殖凋亡

图2 抑制circ_0001361对SW1116凋亡的影响；A 流式细胞图；B Wester blot检测凋亡相关蛋白表达量

2.4 circ_0001361靶向调控miR-136 在Circular RNA Interactome软件中预测到的circ_0001361和miR-136互补序列。circ_0001361(WT)的荧光素酶活性在miR-136组中显著低于miR-NC组(P<0.05)，circ_0001361(MUT)的荧光素酶活性在miR-136组与miR-NC组中无明显差别(P=0.512)。si-circ_0001361组SW1116细胞中miR-136表达量为(2.74±0.09)高于si-NC组的(1.00±0.00)(t=58.000，P<0.05)，pcDNA-circ_0001361组miR-136表达量为(0.47±0.05)低于pcDNA组的(1.00±0.00)(t=31.800，P<0.05)。见图3，表4。

图3 circ_0001361和miR-136的互补序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.5 circ_0001361对芦笋皂苷处理的SW1116增殖凋亡的影响 芦笋皂苷H+pcDNA-circ_0001361组SW1116细胞中circ_0001361的表达量比芦笋皂苷H+pcDNA组增加3.45倍左右，细胞抑制率、凋亡率低于芦笋皂苷H+pcDNA组，克隆数、Bcl-2蛋白表达量高于芦笋皂苷H+pcDNA组，Bax蛋白表达量低于芦笋皂苷H+pcDNA组(P<0.05)。见图4，表5。

图4 circ_0001361对芦笋皂苷处理的SW1116凋亡的影响；A 流式细胞图；B Wester blot检测凋亡相关蛋白表达量

表5 circ_0001361对芦笋皂苷处理的SW1116增殖凋亡的检测

3 讨论

芦笋是一种广受欢迎且健康的蔬菜，富含维生素、矿物质、氨基酸和纤维[9]。新出现的证据表明，包括芦笋在内的许多膳食天然产品具有抗肿瘤活性[14]。从芦笋中提取的皂苷类化合物可能是其抗肿瘤特性的主要活性成分[15]。据报道，芦笋皂苷在不同的癌细胞系中显示出细胞生长抑制作用，例如芦笋皂苷以剂量依赖性方式抑制肝癌HepG2细胞的生长，并通过调节HepG2细胞凋亡相关蛋白(下调Bcl2、上调Bax)的表达诱导HepG2细胞凋亡[16,17]。芦笋皂苷Asparanin A的给药抑制了子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖，减少肿瘤生长，并加速细胞凋亡的发生[18]。此外，芦笋芽甲醇提取物通过激活TRAIL细胞凋亡途径减少结肠癌SW480和SW620的细胞增殖，并最终导致细胞死亡[19]。本研究与前述研究一致，证明芦笋皂苷可抑制结肠癌细胞的生长。

研究表明，circ_0001361在膀胱癌组织和细胞系中高水平表达，并且与病理分级和肌肉浸润呈正相关，circ_0001361通过靶向miR-491-5p/MMP9轴在膀胱癌侵袭和转移中发挥致癌作用[20]。在肺腺癌组织和细胞中，circ_0001361上调；circ_0001361充当miR-525-5p的海绵来上调下游靶标VMA21水平，驱动肺腺癌细胞的生长和转移[21]。但circ_0001361对结肠癌的影响仍未可知。表明抑制circ_0001361抑制了结肠癌细胞的增殖及促进凋亡。这表明circ_0001361有助于结肠癌的肿瘤发生，这是首次报道circ_0001361在结肠癌中的致癌作用。Zhang等[22]利用多组学揭示几种中枢miRNA，它们可能对抗芦笋皂苷Asparanin A的抗子宫内膜癌活性。本研究检测到，结肠癌细胞中circ_0001361表达被芦笋皂苷抑制，miR-136的表达被芦笋皂苷促进，表示芦笋皂苷抗癌活性与circ_0001361/miR-136有关。miR-136作为一种肿瘤抑制因子在结肠癌细胞的增殖和侵袭中发挥负调节作用[23,24]。此外，miR-136充当circ_0109046[25]、circ_0000043[26]在子宫内膜癌、乳腺癌细胞生长中发挥功能的重要靶点。本研究中，circ_0001361靶向miR-136，并负调控miR-136的表达。此外，pcDNA-circ_0001361可以逆转芦笋皂苷对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。这些表明，芦笋皂苷通过下调circ_0001361并靶向负调控miR-136，从而实现其对抗结肠癌发生发展的功能。

综上所述，芦笋皂苷可以通过下调circ_0001361并靶向miR-136，抑制结肠癌细胞增殖和诱导凋亡。芦笋皂苷可能成为预防和治疗结肠癌的有效药物。