不同预处理方法消除流式细胞术检测细胞因子分析干扰的效果

唐甜，王盼，刘宇思，姜拥军，赵敏，张子宁

（中国医科大学 1.国家卫生健康委员会艾滋病免疫学重点实验室；2.国家医学检验临床医学研究中心；3.辽宁省艾滋病免疫学重点实验室；4.附属第一医院检验科，沈阳 110001）

细胞因子作为一种小分子蛋白，在炎症、感染、肿瘤、自身免疫病等多种疾病的发生、发展中具有重要意义，可为免疫相关疾病的诊断、预后评估、疗效监测等提供辅助诊断依据［1］。目前，随着流式细胞术的不断发展，利用流式细胞仪检测患者血清或血浆中的细胞因子水平被越来越广泛地用于临床［2］。流式细胞术检测细胞因子基于流式微球阵列技术，可同时检测一份血清或血浆样本中的多种细胞因子，且具有需要样本量少、省时、操作简单等优点。然而，嗜异性抗体（heterophil antibody，HA）的存在会对基于抗原和抗体的免疫测定法产生干扰，影响流式细胞术检测细胞因子的特异度和准确性［3-4］。因此，本研究采用稀释法、20%聚乙二醇6000（polyethylene glycol 6000，PEG-6000）沉淀法和嗜异性抗体阻断管（heterophilic blocking tube，HBT）预处理流式细胞术细胞因子检测结果异常升高的血浆样本，并将预处理后血浆样本的白细胞介素（interleukin，IL）-6流式细胞术检测结果与电化学发光法检测结果进行比较，以探索有效解决流式细胞术细胞因子检测结果异常升高的血浆样本干扰的方法，为临床诊治提供准确的检测结果。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2021年6月至9月中国医科大学附属第一医院检验科采用流式细胞术检测的血浆样本2 100例，本研究纳入细胞因子异常升高的血浆样本，共32例。纳入标准：（1）流式细胞术检测结果中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）7种细胞因子均异常升高；（2）流式细胞术检测图形异常；（3）部分细胞因子检测结果与患者临床表现以及C反应蛋白、白细胞计数和红细胞沉降率检测结果不符。

同期随机收集正常对照血浆样本14例。纳入标准：（1）细胞因子检测图形正常，且细胞因子检测结果与患者临床表现以及C反应蛋白、白细胞计数和红细胞沉降率检测结果相符；（2）性别、年龄等因素与异常样本相匹配。本研究通过中国医科大学附属第一医院医学伦理委员会审核和批准［科伦审2021（518）号］。

1.2 仪器和试剂

BD FACS CantoⅡ流式细胞分析仪（美国BD公司），细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF）联合检测试剂盒（江西赛基生物科技有限公司），20% PEG-6000（国药集团化学试剂有限公司），HBT（美国CANTIBODIES公司），Cobas 8000A电化学发光仪（美国罗氏公司）。

1.3 样本采集、预处理和检测

1.3.1 样本采集：将外周静脉血置于乙二胺四乙酸真空采血管中，在室温条件下2 000g离心10 min后，留取血浆进行细胞因子检测。

1.3.2 样本预处理：对32例细胞因子异常升高的血浆样本分别进行不同预处理后，采用流式细胞术检测血浆细胞因子水平。

1.3.2.1 稀释法预处理 使用细胞因子检测试剂的配套样本稀释液，对血浆样本进行2倍、4倍和8倍稀释。

1.3.2.2 PEG-6000预处理 将20% PEG-6000与等体积的血浆充分混匀，于室温条件下振荡1 h后，350g离心10 min，吸取上清液进行细胞因子检测。

1.3.2.3 HBT预处理 取500 μL血浆，加入阻断管中静置1 h，吸取上清液进行细胞因子检测。

1.3.3 流式细胞术检测血浆细胞因子水平：将孵育好、包被7种细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF）特异性抗体的捕获微球振荡混匀后，向每个样品管中加入25 μL。再向所有管中分别加入25 μL 藻红蛋白荧光检测试剂和25 μL待测血浆，振荡混匀，室温避光孵育3 h。待孵育完成后，每管加入1 mL PBS洗涤，350g离心5 min，弃上清后向每管加入100 μL PBS，振荡重悬后，上BD FACS Canto Ⅱ流式细胞仪进行检测，采用FCAP Array软件分析、计算结果。

1.3.4 电化学发光法检测IL-6水平：将未经预处理的血浆2 000g离心10 min后，直接采用Cobas 8000A电化学发光仪进行检测。

1.4 统计学分析

使用FacsDivaTM软件处理流式细胞术获得的数据，应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料用M（P25～P75）表示，2组间配对比较采用Wilcoxon检验，多组间配对比较采用Friedman检验。相关性分析采用Spearman相关分析，一致性分析采用Bland-Altman法。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测血浆细胞因子结果分布情况

2 100例血浆样本中，2 068例（98.5%）血浆样本中7种细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF）流式细胞术检测图形正常（以下简称正常表现），包括所有细胞因子表达水平在参考区间内（图1A）或部分细胞因子表达水平高于参考区间上限（图1B），32例（1.5%）血浆样本多细胞因子流式细胞术检测图形异常（以下简称异常表现），表现为流式细胞术检测图形拉长（图1C），或所有细胞因子流式细胞术检测结果均异常升高（图1D）。32例细胞因子异常表现的血浆样本中，24例（75.0%）来源于风湿免疫科，4例（12.5%）来源于肿瘤内科，3例（9.4%）来源于血液科，1例（3.1%）来源于器官移植科。

图1 血浆细胞因子流式细胞术检测图Fig.1 Flow cytometry detection diagram of cytokines in plasma

2.2 稀释法预处理血浆样本后细胞因子的检测结果

将血浆样本2倍、4倍、8倍稀释后，应用流式细胞术检测血浆中7种细胞因子的表达水平。在32例细胞因子异常表现的血浆样本中，7种细胞因子的检测结果与稀释倍数未呈线性关系（P＞ 0.05，r＜0.97）的比例均＞60%（图2A）。在14例细胞因子正常表现的血浆样本中，7种细胞因子的流式细胞术检测结果与稀释倍数均呈较好的线性关系，以IL-6为例（P＜ 0.05，r＞ 0.97），见图2B；而在32例细胞因子异常表现的血浆样本中，血浆样本稀释后21例（65.6%）IL-6检测结果与稀释倍数的线性关系较差（P＞ 0.05，r＜ 0.97，图2C），其余11例（34.4%）IL-6检测结果与稀释倍数呈较好的线性关系。

图2 血浆样本经倍比稀释后细胞因子的表达情况Fig.2 Expression of cytokines in plasma pretreated by a multiple dilution method

2.3 PEG-6000沉淀法和HBT预处理血浆样本后细胞因子的检测结果

细胞因子异常表现的血浆样本经PEG-6000沉淀法或HBT预处理后，应用流式细胞术检测血浆中7种细胞因子的表达水平，结果发现，细胞因子异常升高的现象均得到改善，见图3。

图3 应用流式细胞术检测不同方法预处理细胞因子异常表现的血浆样本后7种细胞因子的检测结果Fig.3 Seven cytokines in plasma samples detected by flow cytometry after different pretreatment methods

细胞因子正常表现的血浆样本经PEG-6000沉淀法和HBT预处理后，与未经预处理的血浆样本比较，7种细胞因子的检测结果无统计学差异（P＞0.05，图4A）。

与稀释倍数未呈线性关系的细胞因子异常表现的血浆样本，经PEG-6000沉淀法和HBT预处理后，7种细胞因子的流式细胞术检测结果均明显低于未经预处理的血浆样本（PEG-6000：均P＜ 0.001；HBT：均P＜ 0.01），见图4B～4H。与稀释倍数呈线性关系的细胞因子异常表现的血浆样本，经PEG-6000沉淀法和HBT预处理后，部分细胞因子流式细胞术检测结果明显低于未经预处理的血浆样本（PEG-6000：IL-6，P＜ 0.01，IL-10，P＜ 0.01，IFN-γ，P＜ 0.01，TNF，P＜ 0.000 1；HBT：IL-10，P＜ 0.01，IFN-γ，P＜0.01；TNF，P＜ 0.000 1），见图4I～4O。

图4 PEG-6000沉淀法和HBT预处理血浆样本后细胞因子的检测结果Fig.4 Expression levels of the cytokines in plasma samples pretreated by PEG-6000 precipitation and HBT

2.4 不同方法预处理血浆样本后流式细胞术与电化学发光法IL-6检测结果的相关性和一致性

对32例细胞因子异常表现的血浆样本（包括11例与稀释倍数呈线性关系的血浆样本和21例与稀释倍数未呈线性关系的血浆样本）进行PEG-6000沉淀法和HBT预处理。结果发现，未经预处理血浆样本的IL-6流式细胞术检测结果与电化学发光法检测结果的相关系数低，经PEG-6000沉淀法和HBT预处理后血浆样本的IL-6流式细胞术检测结果与电化学发光法检测结果的相关性增加，且PEG-6000沉淀法预处理的血浆样本IL-6检测结果与电化学发光法检测结果的相关系数高于HBT预处理的血浆样本（与稀释倍数呈线性关系的血浆样本：PEG-6000，r=0.981 7，HBT，r=0.761 5，图5A～5C；与稀释倍数未呈线性关系的血浆样本：PEG-6000，r=0.854 4，HBT，r=0.830 9，图5D～5F）。

图5 不同方法预处理血浆样本后流式细胞术与电化学发光法IL-6检测结果的相关性Fig.5 Correlation of IL-6 detected by flow cytometry after different pretreatment methods and electrochemiluminescence

进一步进行Bland-Altman分析，结果发现，未经预处理、PEG-6000沉淀法预处理和HBT预处理后的血浆样本中，流式细胞术与电化学发光法IL-6检测结果具有较好的一致性，约90.5%（19/21，21例与稀释倍数未呈线性关系的血浆样本）～90.9%（10/11，11例与稀释倍数呈线性关系的血浆样本）的点在95%一致性界限以内。且PEG-6000沉淀法差值的绝对值以及差值的标准差最小（与稀释倍数呈线性关系的血浆样本：-1.80±3.57；与稀释倍数未呈线性关系的血浆样本：-2.17±5.15），表明PEG-6000沉淀法预处理血浆后，流式细胞术与电化学发光法IL-6检测结果的一致性更好。见图6。

图6 不同方法预处理血浆样本后流式细胞术与电化学发光法IL-6检测结果的一致性Fig.6 Consistency of IL-6 detected by flow cytometry after different pretreatment methods and electrochemiluminescence

3 讨论

HA是人体内源性抗体，在人类接种来源于动物的疫苗以及直接接触已经污染的食物、动物后会产生HA［5］。HA能与多个物种的免疫球蛋白非特异性结合，属多重特异性免疫球蛋白。因此，体内含HA的患者在做血清免疫检测时，HA可与试剂抗体结合而产生干扰。HA的干扰通常会对一种或多种分析物造成错误的高值结果，假性高值结果较常见［6-7］，与本研究发现的细胞因子检测假性升高情况符合。研究发现，存在于人体中的HA包括天然抗体和自身免疫抗体，天然抗体分为天然多特异性抗体、独特型抗体和类风湿性因子，大多数的HA属于天然抗体，是免疫检测分析干扰的主要类型［8］。我院绝大部分患者7种细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF）的检测结果均正常，32例细胞因子检测结果出现异常升高的患者中，24例来自风湿免疫科，其中23例类风湿因子升高。提示类风湿因子升高可能是干扰流式细胞术多细胞因子检测结果的主要原因，临床检测发现细胞因子图形异常或与临床不符时，可关注类风湿因子表达水平。

鉴于HA的多重源性，目前尚无一种能够完全消除HA干扰的手段。连续稀释实验是发现免疫反应中内源性抗体和测量不准确性的有效方法，将血浆样本稀释后，能够降低HA浓度，从而降低原有的干扰强度［9-10］。本研究中，21例患者（21/32）的待检血浆样本经连续稀释后，细胞因子的检测结果与稀释倍数仍未呈明显线性关系，稀释法有效降低干扰的效率仅为34.5%，效果不明显。另外，在与稀释倍数呈线性关系的样本中，PEG-6000、HBT预处理后血浆样本的细胞因子流式细胞术检测结果以及未经预处理血浆样本的细胞因子电化学发光法检测结果大部分降低，部分细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-10等显著下降，这种情况可能是由于这些患者体内HA具有较强的抗体结合能力，不会随着稀释而下降［11］。因此，检测结果与稀释倍数呈线性关系的样本也不能排除存在HA干扰。

另外一种降低HA干扰的方法是使用HA阻断剂，加入阻断试剂或使用HBT，均是利用阻断剂与HA结合从而达到减少干扰的目的。研究［12］报道，HBT能有效降低电化学发光免疫法检测游离前列腺特异性抗原等细胞因子的假阳性率。目前，细胞因子检测尚无金标准，本研究更换了检测平台，同时使用电化学发光法检测IL-6的水平，HBT预处理后的血浆样本流式细胞术检测结果与电化学发光检测结果的相关性有所提高，与稀释倍数呈线性关系的样本差值的绝对值由原来的10.48 pg/mL降为6.07 pg/mL，与稀释倍数未呈线性关系的样本差值的绝对值由原来的16.70 pg/mL降为4.97 pg/mL，且从流式细胞术检测图形来看，HBT预处理也能较好地矫正检测图形（图4C）。因此，HBT在一定程度上能够有效降低干扰。但是，本研究结果中也出现HBT预处理未能有效降低细胞因子检测结果异常升高的情况，检测图形也未得到明显改善，这可能因为这些样本中存在HBT预处理不能阻断的大分子蛋白。

PEG-6000是一种大分子聚合物，具有很强的亲水性，可以破坏水化层使蛋白质分子发生脱水，同时通过空间排斥作用挤压以及依靠链长缠绕蛋白质分子而使其发生沉淀，25% PEG-6000溶液可完全沉淀IgG和IgM以及高达80%的IgA［12］。PEG-6000能有效降低肾上腺激素、促甲状腺素、肿瘤标志物、心脏生物标志物等检测中HA干扰导致的非特异性反应［13-15］。本研究使用PEG-6000降低HA的干扰，结果发现，加入20% PEG-6000对流式细胞术检测细胞因子的正常表现结果不产生影响。对于流式细胞术检测图形异常表现结果，与稀释倍数呈线性关系的血浆样本流式细胞术IL-6检测结果与电化学发光法检测结果的相关性较好，配对数据差值的绝对值由原来的10.48 pg/mL降为1.80 pg/mL，与稀释倍数未呈线性关系的血浆样本流式细胞术IL-6检测结果与电化学发光法检测结果的相关性增加，配对数据差值的绝对值由原来的16.70 pg/mL降为2.17 pg/mL，而且PEG-6000沉淀法能较好地矫正流式细胞术检测图形。因此，PEG-6000沉淀法可以有效减弱分析干扰。

综上所述，应用流式细胞术检测细胞因子时，如发现异常流式细胞术检测图形，应考虑是否存在干扰，PEG-6000沉淀法和HBT均能在一定程度上降低HA的干扰，其中PEG-6000沉淀法的配对数据差值的均数和标准差最小，与电化学发光法的相关性也较好。同时，PEG-6000除了可沉淀HA，对大分子蛋白也有较好的沉淀效果，且其使用成本远远低于HBT［12］。因此，细胞因子的流式细胞术检测中可以尝试应用PEG-6000沉淀法来减弱内源性抗体的干扰，提高检测的准确性。