阿尔茨海默病小鼠模型中TRPC3通过上调ZO-1和LRP-1蛋白表达清除β淀粉样蛋白沉积

张舒蕾，张丽艳，李珍慧，安一鸣，高翔宇

（沈阳医学院基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110034）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）属于神经退行性疾病，临床上以认知功能障碍、人格改变和学习记忆能力进行性减退为主要表现。其发病机制复杂，相关学说众多，如β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）级联假说、血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）受损学说、tau蛋白学说、氧化应激学说、胆碱能损伤学说、钙稳态失调假说等［1］。目前Aβ级联假说占主导地位，该学说认为Aβ在脑内异常沉积是引起患者认知功能障碍的主要原因。过多的Aβ引起神经原纤维缠结形成的同时还会激活小胶质细胞，影响突触功能，出现氧化应激和炎症反应等，这些反应又会进一步促进Aβ在脑内沉积，形成特殊的级联式放大效应［2］。

经典瞬时受体电位通道3（transient receptor potential canonical 3，TRPC3）是瞬时受体电位家族中的一个亚型，广泛表达于平滑肌细胞、内皮细胞和中枢神经系统中，特别是脑海马中。TRPC3主要通过调节钙离子稳态，维持细胞内、内质网和线粒体的钙离子水平，影响神经细胞结构和功能，调节神经元兴奋性和突触的控制［3］。本课题组前期研究［4］发现，AD模型中脑源性神经营养因子可通过上调TRPC3表达，减轻脑海马区的Aβ沉积，发挥神经营养作用，从而改善AD小鼠认知功能。Aβ的清除主要有经BBB转运出脑、细胞吞噬和Aβ降解酶降解3种途径［5］。研究［6］发现，正常生理状况下脑间质液中Aβ的浓度是血液中的6倍，通过BBB将Aβ转运至有强大清除能力的外周血液，是其最主要、最快速的清除路径。BBB对Aβ的高效转运性能主要与脑微血管内皮细胞表面存在的Aβ转运受体，如低密度脂蛋白受体相关蛋白1（low density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP-1）、P糖蛋白（permeability glycoprotein，P-gp）、晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end product receptor，RAGE）等密切相关，同时还与血管壁完整性、配体亲和力和竞争力相关［7］。BBB功能障碍会影响Aβ的正常转运，从而导致Aβ沉积。同时，Aβ沉积会破坏脑微血管内皮细胞和紧密连接相关蛋白，导致BBB丧失完整性［8］。由此可见，BBB功能障碍和Aβ沉积可相互作用，共同促进疾病进展。本研究利用Aβ诱导AD小鼠模型，内源性激活和抑制TRPC3，通过检测小鼠的行为学改变、BBB通透性和功能变化、Aβ转运受体LRP-1表达情况、脑组织和血清中Aβ浓度，探讨TRPC3清除Aβ沉积的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组：60只5周龄雄性费城癌症研究所小鼠（购自辽宁长生生物技术有限公司），体质量24～27 g，采用随机分组原则，分为假手术组、模型组、二酰基甘油类似物（1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol，OAG）组、吡唑化合物［ethyl-1-（4-（2，3，3-trichloroacrylamide）phenyl）-5-（trifluoromethyl）-1H-pyrazole-4-carboxylate，Pyr3］组，每组15只。腹腔注射3.5%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，模型组、OAG组和Pyr3组小鼠侧脑室注射Aβ1-42（410 pmol/3 μL），诱导AD小鼠模型，注射位置在脑中线向右1.1 mm、前囟后0.5 mm处，微量注射器注射深度3 mm，速度为0.6 μL/min，留针5 min。假手术组小鼠侧脑室注射等量灭菌生理盐水。同天，OAG组和Pyr3组小鼠分别腹腔注射TRPC3的特异性激动剂OAG（0.6 μg/g）和TRPC3的特异性抑制剂Pyr3（0.1 μg/g），1次/d，连续21 d，以上调和下调TRPC3的表达。

1.1.2 主要试剂：Aβ1-42（英国Abcam公司）；OAG、Pyr3（美国Cayman公司）；紧密连接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）抗体（美国Affinity公司）；鼠Aβ1-42蛋白抗体（英国Abcam公司）；LRP-1蛋白抗体、β-actin小鼠单克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-HRP（中国Boster生物公司）；伊文思蓝（Evans blue，EB，上海伊卡生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宫实验：造模后第16天开始，持续6 d检测小鼠的学习和记忆能力。圆形水池等距离分为4个象限，装满黑色墨水，水温（25±1）℃。进行定位航行实验，在第3象限内设置1个圆形平台，隐藏在水位下约1 cm处，将小鼠面壁，于不同象限放入池内，记录小鼠上台时间，最长为60 s，若在60 s内未找到平台，则用木棒引导至平台上并停留5 s，3次/d。进行空间探索实验，将平台移走，记录小鼠在60 s内目标象限停留时间、穿越平台次数。

1.2.2 EB染色测定BBB通透性：EB是一种经典的BBB示踪剂，可进行BBB通透性的定量、定性测定［9］。小鼠尾静脉注射2% EB（0.1 mL/10 g），2 h后染料在小鼠体内充分循环，小鼠眼周、鼻唇、四肢等浅表皮肤呈蓝色。水合氯醛麻醉小鼠，用肝素化生理盐水心脏灌流，直到小鼠右心房流出清亮透明液体。取脑组织，称重后置于3 mL甲酰胺中，60 ℃恒温水浴24 h，4 000 r/min离心15 min，取上清液比色，酶标仪检测波长为620 nm的吸光度。根据不同浓度标准品的吸光度绘制标准曲线，计算脑组织EB含量。

1.2.3 Western blotting检测ZO-1蛋白表达：紧密连接受损时BBB通透性增加，ZO-1是目前公认的检测BBB通透性和功能的可靠指标［10］。小鼠末次给药2 h后取脑皮质，切碎均浆，10 000 r/min离心10 min后取上清液，进行蛋白浓度测定。蛋白缓冲液水浴变性后取30 μL上样于5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，室温下垂直电泳2 h，转膜2 h，在摇床上封闭PVDF膜2 h，4 ℃下与ZO-1抗体（1∶1 000稀释）孵育过夜。第2天再与HRP-羊抗兔IgG（1∶5 000稀释）、HRP-羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释）室温下孵育2 h，ECL显影，应用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.4 Western blotting检测LRP-1蛋白表达：LRP-1主要表达于脑微血管内皮细胞的腔外侧，是Aβ的主要转运受体，介导Aβ由脑内向血液流出过程［11］。取脑皮质，蛋白浓度测定同上。制备聚丙烯酰胺凝胶后每孔上样20 μL，室温下垂直电泳2 h，转膜2 h后浸入到5%（M/V）脱脂奶粉溶液中，摇床上封闭2 h，加入LRP-1抗体（1∶3 000稀释）4 ℃孵育过夜。第2天室温下与HRP-羊抗兔IgG（1∶2 000稀释）、HRP-羊抗鼠IgG（1∶1 500稀释）孵育2 h，ECL显影，应用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.5 ELISA测定海马和血清Aβ1-42浓度：小鼠末次给药2 h后断头取血，分离血清。取脑海马，匀浆，低温超速（10 000 r/min）离心10 min后得上清液，进行蛋白浓度测定。按ELISA试剂盒说明书操作，加入标准品、海马和血清稀释样品各100 μL，并加入HRP标记的Aβ1-42检测抗体4 ℃避光孵育过夜。第2天与TMB显色试剂混合15 min，加入终止液，可见溶液颜色从蓝色变为黄色。酶标仪在450 nm测量标准品、样本吸光度值，绘制标准曲线，计算样本的Aβ1-42浓度。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析。数据以±s表示，组间比较采用方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 上调TRPC3对AD小鼠空间学习和记忆能力有改善作用

水迷宫定位航行实验发现，与假手术组比较，模型组第4天、第5天逃避潜伏期明显延长（P＜0.001）；与模型组比较，OAG组第4天、第5天逃避潜伏期明显缩短（P＜ 0.05）；Pyr3组与模型组比较，第4天、第5天逃避潜伏期无统计学差异（P＞ 0.05）。空间探索实验发现，与假手术组比较，模型组目标象限停留时间、穿越平台次数明显下降（P＜ 0.001）；与模型组比较，OAG组目标象限停留时间、穿越平台次数明显增加（P＜ 0.05）；Pyr3组与模型组比较，目标象限停留时间、穿越平台次数均无统计学差异（P＞ 0.05）。结果表明，AD造模成功，TRPC3激动剂对AD小鼠空间学习、记忆能力有改善作用，TRPC3抑制剂对AD小鼠行为学无明显作用。见表1。

表1 Morris水迷宫实验结果Tab.1 Morris water maze experimental results

2.2 上调TRPC3能恢复AD小鼠BBB通透性

与假手术组比较，模型组脑组织EB含量增加（P＜ 0.05），BBB通透性增高；与模型组比较，OAG组脑组织EB含量减少（P＜ 0.05），BBB通透性下降；Pyr3组与模型组比较，脑组织EB含量无统计学差异（P＞ 0.05）。结果表明，TRPC3激动剂能恢复小鼠BBB通透性。见表2。

表2 各组小鼠EB含量、ZO-1和LRP-1蛋白表达水平、海马和血清Aβ1-42浓度Tab.2 EB content，expression of ZO-1 and LRP-1 proteins，and Aβ1-42 concentration in the hippocampus and serum in each group

2.3 上调TRPC3能够促进BBB紧密连接蛋白ZO-1的表达

与假手术组比较，模型组ZO-1表达下降（P＜0.01），表明BBB通透性增加、功能受损；与模型组比较，OAG组ZO-1表达增加（P＜ 0.05），表明受损的BBB通透性、功能有所恢复；Pyr3组与模型组比较，ZO-1表达无统计学差异（P＞ 0.05）。结果表明，TRPC3激动剂能恢复BBB通透性，改善受损的BBB功能。见表2、图1。

图1 Western blotting检测各组小鼠ZO-1蛋白表达情况Fig.1 Zonula occluden-1 protein expression in each group determined by Western blotting

2.4 上调TRPC3能够促进Aβ转运受体LRP-1的表达

与假手术组比较，模型组LRP-1表达下降（P＜0.01）；与模型组比较，OAG组LRP-1表达增加（P＜0.05）；Pyr3组与模型组比较，LRP-1表达无统计学差异（P＞ 0.05）。结果表明，AD小鼠LRP-1表达下降，TRPC3激动剂能促进LRP-1的表达。见表2、图2。

图2 Western blotting检测各组小鼠LRP-1蛋白表达情况Fig.2 Low density lipoprotein receptor-related protein-1 expression in each group determined by Western blotting

2.5 上调TRPC3可促进脑组织的Aβ1-42向外周血转运

与假手术组比较，模型组小鼠海马和血清的Aβ1-42浓度均升高（P＜ 0.01，P＜ 0.05）；与模型组比较，OAG组小鼠海马Aβ1-42浓度下降（P＜ 0.05），血清Aβ1-42浓度升高（P＜ 0.05）；与模型组比较，Pyr3组小鼠海马Aβ1-42浓度无统计学差异（P＞ 0.05），血清Aβ1-42浓度下降（P＜ 0.01）。结果表明，上调TRPC3可减轻脑部Aβ1-42沉积，并促进其向外周血转运。见表2。

3 讨论

AD的病理特点为Aβ 在脑内异常沉积形成老年斑，tau蛋白过度磷酸化形成神经元纤维缠结，海马等脑区突触和神经元大量丢失等［12］。Aβ由淀粉样前体蛋白产生，若出现代谢障碍，Aβ会沉积于脑并产生神经毒性，导致患者出现认知功能障碍。因此，找到减少脑部Aβ沉积的方法可能是治疗AD的关键。Aβ是一种极性、可溶性大分子物质，不能通过自由扩散方式在脑组织和外周血中转换。在Aβ的多种清除机制中，经BBB转运出脑是最主要的方式。大量研究表明，Aβ主要通过转运受体清除，如LRP-1、P-gp、RAGE等转运受体均高表达于脑微血管内皮细胞。研究［13-14］发现，AD中LRP-1表达降低；若抑制健康小鼠LRP-1的脑内表达，Aβ的外周转运率下降30%。脑微血管内皮细胞是BBB的重要组成成分，紧密连接使脑微血管内皮细胞形成连续的单层物理屏障，使跨细胞自由扩散受到抑制，同时还会调节离子、复合物在脑内流动。ZO-1是紧密连接蛋白中最主要的胞质蛋白，在许多神经功能障碍疾病中，ZO-1缺乏不仅直接影响紧密连接蛋白构成，其水平降低还是BBB损伤的重要标志。

本研究中，模型组EB含量增加，ZO-1、LRP-1表达下降，表明BBB受到破坏，BBB通透性增加，Aβ转运功能降低，Aβ清除不力，海马和血清的Aβ1-42浓度升高；而OAG组EB含量降低，ZO-1、LRP-1表达增加，表明在TPRC3激动剂的作用下，受损的BBB功能得到改善，BBB通透性降低，Aβ转运功能增强，海马Aβ1-42浓度降低，Aβ转运到周围血管，血清Aβ1-42浓度升高。

本课题组前期研究［14］发现，激活TRPC3表达可减轻脑部Aβ沉积，从而改善AD小鼠认知功能和突触功能障碍。本研究证明，TRPC3的激活表达，可能通过修复LRP-1等Aβ转运蛋白功能，加速Aβ清除，从而改善小鼠的认知功能。但尚不清楚TRPC3通过何种途径修复BBB及LRP-1等Aβ转运受体功能，需进行进一步实验探讨。

本研究中，给予TRPC3抑制剂后小鼠海马Aβ1-42浓度改变不明显。原因在于AD小鼠模型是通过侧脑室注射高浓度Aβ造模，即使Aβ转运功能受到抑制，海马Aβ浓度也不会有明显改变。但肝脏、肾脏等脏器对已通过BBB的Aβ有强大的清除能力，所以给予TRPC3抑制剂后，小鼠血清Aβ1-42浓度相对下降。

综上所述，本研究表明，激活TRPC3可恢复BBB功能，增加Aβ转运受体LRP-1蛋白表达，进而清除脑组织Aβ沉积，改善AD行为学症状。