毛霉目病原真菌的实验室鉴定及体外抗真菌药物敏感性分析

袁凯旋，叶静如，禄梦笛，陈卓曦，凌勇，黄爱伟，刘素玲，顾兵

(1.广东省人民医院/广东省医学科学院，广州 510080；2.广东医科大学医学技术学院，广东东莞 523808)

毛霉病(mucormycosis)是由毛霉目(Mucorales)病原真菌引起的侵袭性真菌感染，主要侵犯免疫受损患者，可引起局限性和播散性感染。近年来，随着各种激素、抗菌药物、化疗药物及免疫抑制剂的广泛应用，毛霉病发病率整体呈上升趋势，该病的全因死亡率为40%～80%[1]。毛霉病早期临床表现与影像学表现缺乏特异性，临床诊断困难，进展迅速。因此，实现毛霉病的早期快速诊断尤为重要。然而，基于传统形态学对毛霉目真菌进行鉴定的要求较高，部分种属形态特点高度相似，且为常见的环境污染真菌，需结合直接镜检标本和组织病理切片进行判断，但镜检敏感性较低，病理切片对毛霉菌丝难以区分。再者，毛霉目对两性霉素B存在较明显的种间和种内差异[2]，对泊沙康唑存在较明显的种内差异[3]，因此对于毛霉目真菌感染，不论何种菌属都统一推荐两性霉素B或泊沙康唑作为经验治疗首选药物，可能会导致治疗失败。

国内大多数实验室对毛霉目真菌的实验室检测水平和开展抗真菌体外药敏试验能力有限，相关药敏研究数据较少。基于以上现状，本研究以分子测序结果为参考，评估临床标本镜检、菌落形态学鉴定和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)对毛霉目真菌的鉴定能力，分析其对两性霉素B、泊沙康唑的体外药敏特点，为毛霉病的实验室检测流程提供思路，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1菌种来源 回顾性分析2018年1月—2022年2月在广东省人民医院住院确诊或临床诊断为毛霉病的患者25例，所有患者培养结果均为阳性。阳性标本包括创面分泌物(10例，40%)、肺泡灌洗液(8例，32%)、纤支镜冲洗液(4例，16%)、肺穿刺组织(2例，8%)、粪便(1例，4%)。病例确诊、临床诊断标准遵循2021年欧洲医学真菌学联合会(European Confederation of Medical Mycology，ECMM)与真菌病研究小组教育与研究联合会(Mycoses Study Group Education & Research Consortium, MSGERC)联合发布的侵袭性真菌病指南[4]。

1.2主要仪器与试剂 PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)，Vitek MS质谱仪(法国生物梅里埃公司)，UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司)，光学显微镜(日本Olympus公司)，霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，CO2培养箱(美国FORMA公司)；一次性靶板、基质液、甲酸(法国生物梅里埃公司)，大肠埃希菌ATCC 8739(美国菌种保存中心)，乙腈(天津科密欧公司)，SDA平板(江门凯林贸易有限公司)，Ezup柱式真菌基因DNA抽提试剂盒、通用引物ITS1和ITS4、Taq PCR Master Mix(上海生工生物公司)，两性霉素B(合肥博美生物公司)，泊沙康唑(广州亿源生物公司)。

1.3形态学鉴定

1.3.1直接镜检 25例标本均采用革兰染色法和10%氢氧化钾(KOH)湿片法[5]镜检。对于肺泡灌洗液或纤支镜冲洗液，取沉淀物涂片于载玻片上；对于创面分泌物或粪便，将运送拭子涂抹于载玻片中间；对于组织标本，以无菌剪刀剪碎，置于盖玻片上。每份标本制片2张，1张进行革兰染色，另外1张行10% KOH湿片法镜检。

1.3.2形态鉴定 将菌株复苏于SDA平板，于28 ℃霉菌培养箱培养24～48 h后，采用透明胶带法[5]观察菌丝及孢子形态特征。根据菌落和镜下特点进行形态学鉴定。

1.4菌株复核 根据Ezup柱式真菌DNA抽提试剂盒说明书提取DNA，利用真菌通用引物ITS1和ITS4对内转录间隔区进行PCR扩增，引物序列为ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反应总体积为50 μL，包括Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA模板5 μL，0.2 μmol/L上、下游引物各2 μL，ddH2O 16 μL。扩增条件：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 延伸7 min。PCR产物由上海生工生物公司完成测序，测序仪型号为ABI 3730XL。使用Chromas 2软件分析结果，并使用ContigExpress软件将两端序列进行拼接和手动矫正后，在NCBI和MYCOBANK数据库上进行比对，种、属信息鉴定原则参照文献[6]。

1.5质谱鉴定 磁珠研磨法：在法国生物梅里埃公司提供的方案上予以改良，使用潮湿的拭子收集孢子和菌丝，将其悬于含900 μL 70%乙醇的预装提取管中灭活10 min，置于垂直震荡器研磨15 min后将菌悬液转移至2 mL无菌EP管中，(10 000～14 000)×g离心2 min，弃上清液，待乙醇完全挥发后加入40 μL新鲜配制的70%甲酸涡旋震荡混匀，加入40 μL乙腈涡旋震荡混匀，(10 000～14 000)×g离心2 min。取1 μL上清液点靶2次，干燥后覆以1 μL基质液，待其形成结晶后进行检测。采用IVD数据库(v3.2)和RUO数据库(v4.17)进行判断，其中IVD数据库包含真菌221种，RUO数据库包含真菌518种。每株菌株重复检测2次，若第一次无鉴定结果，则按照上述流程二次检测，若仍无结果，则认为鉴定失败。

1.6微量肉汤稀释法 按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M38-A2文件[7]操作。将25株受试菌接种于SDA上，置28 ℃培养3～5 d后用8.5 g/L生理盐水收集孢子，使用血细胞计数板调整菌悬液浓度为(0.2～2.5)×105CFU/mL，使用RPMI-1640肉汤1∶50稀释，最终使孢子浓度为(0.4～5)×104CFU/mL，分别吸取100 μL孢子悬液与药液加入U型96孔培养板，最后1孔作为生长对照孔，加入100 μL孢子悬液和100 μL RPMI-1640肉汤，置37 ℃培养21～26 h后记录其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，计算能抑制50%菌株生长所需的MIC(MIC50)、抑制90%菌株生长所需的MIC(MIC90)、MIC的几何均数(geometric mean，GM)和MIC范围。当孔内出现100%生长抑制时所对应的浓度为泊沙康唑与两性霉素B的MIC。质控菌株为烟曲霉ATCC MYA 3626。

1.7统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行数据分析。计数资料采用百分率表示，率的比较行χ2检验。不同种抗真菌药物的MIC比较采用独立样本t检验，不同属毛霉目真菌的MIC值比较采用秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1标本直接镜检结果 KOH湿片法镜检阳性率为76%(19/25)，革兰染色法阳性率仅为32%(8/25)，差异有统计学意义(χ2=9.742，P=0.002)。

2.2形态学鉴定结果 13株正确鉴定为根霉属，鉴别特点为：菌落生长速度快，绒毛样，孢子囊与假根对生，可见囊轴和囊托(图1A、B)；3株正确鉴定为横梗霉属，鉴定特点为：初期白色绒毛样菌落，生长速度快，孢子囊多呈梨形，囊轴锥形，有漏斗状囊托和囊领(图1C、D)；3株正确鉴定为小克银汉霉属，鉴别特点为：菌落白色，生长速度快，球形或梨形孢囊可长出小型孢囊，形成膨大的齿状(图1E、F)；1株正确鉴定为毛霉属，鉴定特点为：菌落白色，生长速度快，孢囊梗可见分枝，无假根，无囊托(图1G、H)；3株横梗霉因镜下结构相似性高，错误鉴定为伞枝横梗霉；1株微小根毛霉(图1I、J)和1株不规则毛霉(图1K、L)无法通过形态学鉴定。68%(17/25)的菌株可形态学鉴定到属水平。

注：A～B，根霉属；C～D，横梗霉属；E～F，小克银汉霉属；G～H，毛霉属；I～J，微小根毛霉；K～L，不规则毛霉。图1 毛霉目真菌在SDA培养24 h的菌落与镜下特点(400×)

2.3菌株复核结果 分子测序可将所有菌株准确鉴定到种水平，鉴定率为100%，其中，少根根霉9株(36%)，灰色小克银汉霉3株(12%)，伞枝横梗霉3株(12%)，小孢根霉3株(12%)，Lichtheimiaornata2株(8%)，微小根毛霉、总状横梗霉、卷枝毛霉、不规则毛霉和Lichtheimiahyalospora各1株。见表1。

2.4质谱鉴定结果 使用IVD数据库总鉴定率为56%(14/25)，2株(8%)少根根霉无鉴定结果，9株(36%)因不在IVD数据库导致无法鉴定，剔除数据库缺少的菌株，鉴定率为87.5%(14/16)；使用RUO数据库总鉴定率为44%(11/25)，5株(20%)出现鉴定错误，2株(8%)无鉴定结果，5株(20%)因不在IVD数据库导致无法鉴定。剔除数据库缺少的菌株，鉴定率为55%(11/20)。联合IVD和RUO数据库时，总鉴定率为64%(16/25)，比使用单一数据库有所提高。见表1。

表1 25株毛霉目真菌的分子测序与质谱鉴定结果[n(%)]

2.5药敏结果 烟曲霉ATCC MYA 3626的MIC值均在质控范围内。25株受试菌两性霉素B的MIC值范围为0.125～32 μg/mL，84%(21/25)的菌株MIC≤2 μg/mL，两性霉素B MIC50为1 μg/mL，MIC90为8 μg/mL，其中4株少根根霉表现出较高的MIC值(2株MIC>32 μg/mL，另2株MIC为8 μg/mL)。泊沙康唑MIC值范围为0.062 5～8 μg/mL，MIC50为2 μg/mL，MIC90为4 μg/mL，68%(17/25)的菌株MIC≤2 μg/mL，与两性霉素B相比，差异无统计学意义(χ2=1.754，P=0.185)；28%(7/25)菌株MIC值为4 μg/mL，主要见于横梗霉属，1株少根根霉MIC值为8 μg/mL。对于泊沙康唑，12株根霉属的MIC50为0.5 μg/mL，MIC90为4 μg/mL；7株横梗霉属MIC50和MIC90均为4 μg/mL；2株毛霉属MIC值≤1μg/mL；3株灰色小克银汉霉，1株MIC为4 μg/mL；1株微小根毛霉MIC为2 μg/mL。对于两性霉素B，根霉属的MIC50为2 μg/mL，MIC90为8 μg/mL；横梗霉属MIC50为1μg/mL，MIC90为2 μg/mL；2株毛霉属MIC值≤0.5μg/mL；3株灰色小克银汉霉MIC≤2 μg/mL；1株微小根毛霉MIC为2 μg/mL。总体上，两性霉素B对大部分毛霉目真菌的MIC值较低，但对少根根霉却表现出较高MIC值。泊沙康唑对毛霉目真菌的MIC值较分散，有表现出较低MIC值，同样也有部分菌种对泊沙康唑表现出较高的MIC值。见表2。

3 讨论

毛霉菌早期诊断是影响治疗成功的重要因素[2-3]。然而，以常规方法对毛霉目中的菌种进行鉴定，对实验室硬件和人员均要求较高。革兰染色法是常规进行真菌镜检的方法，但毛霉菌丝不易着色，与背景颜色不易区分，易出现漏检的情况。KOH湿片法操作简单，可呈现菌丝未染色的原生态特点，不易与背景杂质相混淆。当镜检见菌丝扭曲或丝带状折叠、无分隔或偶尔有分隔、分枝不规则、通常呈直角分枝时，可初步判断为阳性结果，建议涂片结果报告为查见真菌菌丝，宽大无隔或少分隔、直角分枝，疑似毛霉目真菌，以早期提示临床[8]。本研究KOH湿片法对于毛霉菌丝的检出率明显优于革兰染色法，建议在日常工作中可将两种方法配合使用，提高镜检阳性率。然而，直接镜检仍存在漏检和敏感性低的现象，实验室应开展更为敏感的染色方法，如荧光染色和六铵银染色等。

小克银汉霉属和共头霉属可通过镜下形态识别，根霉属可根据假根、分枝的有无而鉴定。然而，对于根毛霉属、横梗霉属或毛霉属，基于形态特征进行鉴定较困难。Yang等[9]研究发现，有3株毛霉因具有圆形的孢子囊而不像横梗霉属梨形的孢子囊，形态学错误鉴定为根毛霉。然而正如本研究所发现，临床上经常会出现形态学不典型或少见的毛霉菌株，3株横梗霉因镜下相似度高而错误鉴定为伞枝横梗霉，1株微小根毛霉因未发现假根而无法鉴定，1株不规则毛霉因产孢结构不典型和笔者经验不足而无法鉴定。因此，亟需提升自身形态学鉴定能力并持续进行同质化培训，以提高实验室整体的鉴定水平。

MALDI-TOF MS可实现部分菌株的准确鉴定。de Carolis等[10]用MALDI-TOF MS对包括毛霉在内的103株菌株进行质谱鉴定，结果可将96.8%的菌株实现种水平的鉴定，其中包括伞枝横梗霉、总状横梗霉、微小根毛霉和卷枝毛霉。本研究中单用IVD数据库鉴定率为56%，使用RUO数据库鉴定率为44%，2个数据库联合可提高至64%。质谱对毛霉目真菌鉴定效果一般，2个数据库在图谱处理、比对方法和菌种种类的不同是导致鉴定差异的可能原因。由于质谱本身的局限性，复合群中各个种呈现同一水平的相似性，其在种鉴定方面尚有一定难度，例如少根根霉复合群和小孢根霉复合群。再者，数据库的拓展是提高鉴定率的方法之一。Shao等[11]利用Bruker自建库在种和属水平上分别鉴定出90株(81.1%)和111株(100%)毛霉目真菌。因此，实验室需不断更新和拓展数据库，优化丝状真菌质谱鉴定流程。

对于表型和质谱无法鉴定的毛霉菌株，分子测序是其鉴定的金标准，主要方法是利用真菌通用引物ITS1和ITS4对真菌间接转录区进行扩增[12]，亦可联合多对引物以提高毛霉鉴定能力。本研究中，分子测序可将25株毛霉准确鉴定到种或变种水平，发现分离率最高为少根根霉，准确率为100%，可见分子测序方法能够有效地鉴别毛霉目真菌，弥补传统形态学和质谱鉴定的不足。在日常工作中，对于形态学鉴定困难的毛霉目真菌，可使用质谱对其初步鉴定，对于质谱无法鉴定的菌株，可使用分子方法对其最终鉴定。但是，部分毛霉难以培养，对于高危患者，建议对其肺泡灌洗液或组织等行实时荧光PCR检测，从而提高毛霉病的诊断能力。相关研究发现实时荧光PCR检测血清中的毛霉DNA，比组织学和/或培养平均早8 d(最多24 d)，比影像学结果早3 d[13]。尽管分子方法正在完善，但形态学鉴定仍是实验室常规使用的方法，因此毛霉病的诊断仍具挑战性。

因此，为提高毛霉病实验室诊断能力，亟需将传统镜检、培养、质谱技术和分子测序相结合，实现毛霉目真菌种水平的鉴定，并积极开展体外抗真菌药敏试验，从而为临床早期治疗提供参考依据。