新型冠状病毒核酸全自动PCR检测系统临床应用江苏专家共识

江苏省医学会检验学分会，江苏省临床检验中心

核酸检测是新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019, COVID-19)人群筛查、确诊、出院随访和流行病学调查的最重要依据[1-2]。新型冠状病毒核酸全自动聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测系统(简称新冠核酸全自动PCR检测系统)是集样本识别和转移、核酸提取和纯化、体系构建、基因扩增和检测功能为一体或组合为一体的高度自动化核酸检测系统；其利用机械自动化代替常规核酸检测中的手工操作过程，实现取样后直接在封闭或半封闭的检测系统中完成整个测定。与传统新冠核酸检测系统相比，全自动PCR检测系统具有流程简化、精确度高、生物安全风险低和缓解人力资源紧张等优势，部分种类的全自动PCR检测系统还实现了样本随到随检，不需要样本等待时间；可适用于急诊、发热门诊、常规以及大规模核酸检测等多种应用场景；极大地降低了大规模筛查时人员不足的压力，避免了复杂人工操作导致的差错和结果不准确，同时也减少了实验中辅助设施设备的需求，有助于核酸检测能力和效率的全面提升。因此，新冠核酸全自动PCR检测系统备受关注。

然而新冠核酸全自动PCR检测系统的应用也给临床实验室带来了一些新的问题和疑惑，如是否需要在生物安全二级实验室开展检测、是否需要专业人员操作、实验室如何设置、如何保证仪器的良好运行、如何进行质量控制、如何进行复检等。为规范新冠核酸全自动PCR检测系统在临床中的应用，减轻人员压力并保证实验室检测效率和检验质量，江苏省医学会检验分会和江苏省临床检验中心组织省内检验医学和分子生物学等领域的相关专家共同制定本专家共识。

1 定义、分类、术语

1.1定义 新型冠状病毒核酸全自动PCR检测系统是指样本识别和转移、核酸提取和纯化、体系构建、基因扩增和检测全流程自动化的核酸检测系统。

1.2分类 该系统目前主要有以下3种模式。(1)一体化随机处理式：检测系统一体化，样本随到随检，具备处理单管样本的功能；(2)一体化批处理式：检测系统一体化，样本分批集中处理和检测，无需实验人员手动操作；(3)组合型批处理式：检测系统非一体化，通常由配套或推荐的全自动分杯处理系统、全自动核酸提取工作站和荧光定量扩增仪组合而成，样本分批集中处理和检测，部分步骤需要人员参与手工操作。

1.3术语与解释 下列术语与解释专用于本共识。

1.3.1样本识别和转移 包含自动化条码识别和信息录入、样本管开盖和关盖以及样本吸取和加样的过程。

1.3.2核酸提取和纯化 包含样本裂解释放核酸，核酸被结合进行洗涤、纯化和洗脱的过程。

1.3.3体系构建 包含PCR反应体系的配制和分配以及核酸点样的过程。

1.3.4基因扩增和检测 包含PCR反应管封盖或反应板封膜、PCR扩增以及荧光采集和检测的过程。

1.3.5随机处理式 单管式进样，每个样本作为单独的反应管进行处理和检测的模式。

1.3.6批处理式 成批式处理样本且每批样本同时检测的模式。

1.3.7检测系统一体化 即一体化检测系统，集样本识别和转移、核酸提取和纯化、体系构建、基因扩增和检测的全过程在一台自动化仪器设备上完成。

1.3.8自动报告模式 新冠核酸全自动PCR检测系统通过与实验室信息管理系统(laboratory information management system，LIS)对接自动给出检测结果报告；但该报告只能作为结果提示，需经人工审核后才能签发。

2 实验室的资质要求

共识1：使用新冠核酸全自动PCR检测系统的实验室应具备开展常规新型冠状病毒核酸检测的资质，符合生物安全要求。

实验室应符合《医疗机构临床基因扩增管理办法》及其工作导则《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》(卫办医政发〔2010〕194号)和《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》(联防联控机制医疗发〔2020〕313号)的要求，并具备以下资质：医疗机构执业许可证及其相应的二级诊疗科目“临床细胞与分子遗传学专业”、Ⅱ级或Ⅱ级以上生物安全实验室备案证书、临床基因扩增检验实验室技术验收合格证(新冠专项或感染类)。

实验室各岗位人员均应在生物安全风险评估的基础上，采取适当的个体防护措施，包括手套、口罩、帽子、防护服和/或隔离衣等。

3 人员要求

共识2：实验室检测技术人员在数量上应满足开展该项目检验及工作量的需求，并参加必要的外部培训和充分的内部培训，具备相应资质并通过相应能力评估及授权后方可上岗。

实验室检测技术人员应满足《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》(联防联控机制医疗发〔2020〕313号)的基本要求。尽管新冠核酸全自动PCR检测系统操作相对简单，但仍须进行性能验证、设备维护、生物安全防控、质量控制和结果分析判断等。检测技术人员应当具备相关专业的大专以上学历或具有初级及以上专业技术职务任职资格；持有省级卫生行政部门指定机构颁发的临床基因扩增检验实验室技术人员岗位培训合格证书(新冠专项或感染类)；经过与所操作的检测系统相关的实验室内部技术培训且考核合格，掌握仪器使用、参数及程序设定、样本装载、试剂准备、日常维护和质量控制等常规操作技能；完成有关生物安全的培训和考核。报告签发人员还应同时具备检验专业技术资格证书。

4 实验室的设置

共识3：采用全自动一体化检测系统进行新冠病毒核酸检测时，实验室可进行区域的适当合并；如果该系统与传统新冠病毒核酸检测系统并存，则应单独分区，且试剂和耗材应储存在清洁区。

实验室设置应符合《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》和《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》(联防联控机制医疗发〔2020〕313号)的要求，原则上应设置3个在物理空间上完全分隔的进行实验活动的核心工作区：试剂配制区、样本制备区和扩增检测区，且各区域均须设置缓冲区并确保良好的通风以及人员、物品、样本和废弃物的单向流动。可根据全自动PCR检测系统的组成和功能因地制宜进行实验室设置，如核酸提取和扩增检测一体化时，样本制备区与扩增检测区可合并(图1A)；如核酸提取、体系构建、扩增检测一体化时，试剂配制区、样本制备区和扩增检测区可合并(图1B)；但均应独立于传统新冠病毒核酸检测的样本制备区和扩增检测区(如果两类检测系统在实验室同时存在)，单独分区(图1C或1D)。另外，试剂和耗材的储存应放置于库房、试剂储存区或试剂配制区，不应放置在上述合并区域。

实验室应当配备相适宜的辅助仪器设备，包括A2型生物安全柜、振荡器、保存试剂和样本的冰箱/冰柜、不间断电源(uninterruptible power system，UPS)等。为防止核酸污染，高压锅不允许放置在进行实验的任何工作区。

注：A，标本制备区与扩增检测区合并时；B，试剂配制区、标本制备区和扩增检测区合并时；C、D，新冠核酸全自动一体化检测系统与传统检测系统共存时。图1 新冠核酸全自动PCR检测系统实验室分区设计示意图

5 仪器设备

5.1工作环境

共识4：新冠核酸全自动PCR检测系统的工作环境应能保证仪器设备的正常运转，不影响检验结果的有效性，不对所要求的测定质量产生不良影响。主要环境指标应符合生产商使用说明书的要求，包括但不限于安装空间、震动或电磁干扰、通风、照明、温湿度、电源的电压/频率/功率、用水质量和排水要求等，应使用适宜的UPS，保证仪器用电的质量和安全。

实验室应监测和记录上述环境指标，确保其符合常规检测要求。

5.2验证

共识5：实验室应基于生产商说明书，制定仪器设备使用前的性能验证方案,用于对仪器性能的评估，确定其分析性能与生产商说明书规定参数的符合程度，包括机械臂定位、液面监测、吸液量、移动力、温度、仪器内气流控制、报警功能等。

实验室使用的分析仪器或检测系统应取得国家药品监督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)注册文件。

5.3使用和维护

共识6：实验室应基于生产商说明书，制定仪器设备的常规使用、维护保养、清洁、去核酸污染处理等标准操作程序(standard operating procedure, SOP)；维护保养至少应包括但不限于以下内容：每天/批实验结束后仪器加样装置和管道的冲洗、清洁、去核酸污染处理，洗液和废弃物的及时清理；仪器的废液管、滤膜、蠕动泵头、紫外灯的定期更换，等等，并做相应记录。

生产商应在说明书中明确描述仪器设备的使用及日常维护保养等要求；对于未提供但可能会影响检验结果质量的任何操作，实验室都应与厂方工程师一起编写相应SOP，做好使用以及日、月、季、年的维护保养。

5.4校准

共识7：实验室应基于生产商说明书，制定相应的校准程序，规定仪器设备或检测系统的校准方法、频率、关键参数及其符合标准，主要内容包括但不限于：加样系统(吸液量准确度和重复性、机械臂定位精度)、提取系统(温度准确度和均一性)、扩增系统(荧光本底和荧光值精准度、升降温速度、温度准确度和均一性)、生物安全系统(紫外灯、HEPA过滤系统)等，保证其满足预期的性能。

仪器的良好运行状态是检测结果准确性的重要保证。实验室应根据生产商说明书和相关行业规范定期校准仪器[3-5]，可根据仪器的使用频率、发生异常情况的概率等酌情增加校准次数或部分参数的校准次数，并做好记录。校准周期内，仪器还需要定期或不定期地进行期间核查，通常由厂方工程师完成，以确保仪器性能状态的稳定性。

5.5常见故障原因、排除和处理

共识8：新冠核酸全自动PCR检测系统在运行过程中，任何一个零部件的故障都会影响最终的检测结果和检测效率。常见故障通常包括吸样故障、机械臂故障、贴膜或封盖故障、扩增模块故障、通讯故障等。一旦发现可能影响分析性能的仪器故障，需立即停止操作，分析故障原因并排除故障；故障修复后需验证或校准，证实恢复正常后方可使用[6]。

5.5.1吸样故障 主要涉及样本前处理、提取、扩增等阶段，出现空吸、堵针或吸液滴漏，常见原因通常有加样轴气密性差、样本问题(空管、黏液过多或混采管棉签过多等)、零部件(如注射泵、管道磨损、驱动板、电机板等)发生异常。因此，在操作之前，实验室应检查吸样头与轴的气密性，采样管液体量和外观是否符合要求，上样管内有无气泡或黏液过多等；如出现上述零部件故障，应联系厂方工程师及时更换。

5.5.2机械臂故障 主要发生在加样、提取、扩增阶段，常见原因是耗材不配套或放置不到位、移动过程中发生卡板、参数设置错误等。实验室应选择检测系统配套的耗材，核对设置参数，记录发生机械臂故障时的仪器状态等。如机械臂故障实验室无法自行处理或频繁发生时，应及时联系厂方工程师维修并定期维护和保养。

5.5.3贴膜或封盖故障 主要为反应板与封膜之间有缝隙或八联管未密闭，常见原因是温度传感器或加热模块故障导致温度低、参数设置错误。实验室应观察和记录贴膜或封盖故障发生的情况、频率等，联系厂方工程师进行相应处理(如调整压力、温度、更换模块等)和维护保养。

5.5.4扩增模块故障 包括温度控制模块故障及荧光采集模块故障。发生温度控制模块故障时，实时温度跟踪界面会显示异常变温曲线，不升温或者不降温，检测结果重复性差，常见原因为温度控制电路板故障、加热模块故障或仪器散热异常。荧光采集模块故障主要表现为荧光曲线本底分层、无荧光值、荧光扩增效率低或个别孔位荧光异常等，常见原因为荧光采集系统故障、孔位有杂质等。厂方工程师应定期对扩增模块的温度、荧光采集及光路系统进行维护或校准，并定期清洁扩增孔位。

5.5.5通讯故障 全自动PCR检测系统使用过程中也可能会出现通讯故障，如软件操作与仪器响应异常、仪器软件与LIS间通讯异常或仪器不同组件间通讯异常，可能与网络IP设置、网线连接等相关，可通过联系厂方工程师和/或LIS工程师解决。

6 试剂耗材

6.1病毒采样管

共识9：实验室应规范病毒采样管的使用。原则上应当使用配套采样管，若特殊情况需使用非配套采样管，一是需厂方提供已经确认的推荐品牌及其相应实验数据，二是需实验室在临床使用前通过实验比对证实非配套采样管能满足其检测系统要求。

病毒采样管包括采样液和采样拭子，目前基本为一类备案试剂，无国家或行业有关采样液成分及配比等的标准。因采样液的成分(如胍盐/表面活性剂)浓度对后续核酸提取试剂的提取效率产生影响，实验室应当使用新冠核酸全自动PCR检测系统配套或推荐的采样管。采样管和拭子的规格、材质以及采样液种类和容量的要求应符合《新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范》(联防联控机制医疗发〔2020〕352号)和《新冠病毒核酸20合1混采检测技术规范》(联防联控机制医疗发〔2022〕21号)等的规定。

6.2试剂

共识10：应使用与新冠核酸全自动PCR检测系统配套或推荐的核酸提取试剂和扩增检测试剂，包括提取试剂与检测试剂之间、提取或检测试剂与相应仪器之间的配套或推荐；且更换提取或检测试剂品牌时，需进行整个检测系统的性能验证或确认。检测试剂的分析灵敏度应适宜于不同混采模式的要求。

实验室使用的检测试剂应取得NMPA批准文件，分析灵敏度以及检测靶点和数量应满足国家发布的新冠病毒核酸检测的相关要求，且与不同比例的混采模式相适宜；应使用检测试剂配套的或其说明书中推荐的核酸提取试剂，若特殊情况需使用非配套或非推荐提取试剂，实验室应在临床应用前通过实验比对确认非配套试剂能满足其检测要求。批号更换或同一批号货号更换时，提取试剂和检测试剂均需进行实验比对验证。

6.3耗材

共识11：新冠核酸全自动PCR检测系统使用的耗材主要包括各种规格的吸头、扩增反应管或板、深孔板或提取条、磁棒套(适用时)等，应配套使用；已放置在检测系统内的各类耗材，应有防错设计，避免加样臂被污染或损坏；检测系统应具备“耗材是否放置正确和到位”的警示功能。

7 检验前过程

7.1样本采集、运输和保存 同常规新冠病毒核酸检测，样本的采集、运输和保存应遵照《新冠病毒样本采集和检测技术指南》[《新型冠状病毒肺炎防控方案(第九版)》(联防联控机制医疗发〔2022〕71号)附件)]等的相关规定。

7.2样本前处理

共识12：样本条形码的识别和信息采集依据各生产商说明书进行设置。如样本条形码识别失败，可选择手动录入或者外接扫码枪手动扫描至相应样本孔位。如样本管开盖失败，仪器会复位后重新开盖(重复开盖次数建议设置为≥2次)，一旦仪器仍无法开盖应选择单步调试界面进行操作，或根据仪器报警提示找到对应样本，进行手工加样(适用时)。

8 检验过程

8.1性能验证

共识13：实验室应基于试剂和仪器生产商说明书，建立检测操作全流程的SOP；且在开展临床常规检测前，对整个检测系统(含配套或匹配的试剂、耗材、仪器和软件等)进行独立的性能验证；建议至少包括方法符合率、重复性、检出限(分析灵敏度)、携带和交叉污染率[6-8]；实验室可根据检测系统的功能及其临床预期用途，增加验证内容。

8.1.1方法符合率 依据生产商说明书及相关指南[7]，实验室可以使用含有ORF1ab基因和N基因双靶RNA序列的已知浓度的假病毒阳性质控品和阴性临床样本进行方法符合率验证，阳性质控品应尽量与待测临床样本基质接近且包含接近检出限的浓度水平。方法符合率应达到100%。

8.1.2重复性 当重复测试同一样本并引入多个变量时，应评估检测系统的可重复性。可由不同的操作人员在不同的日期运行检测系统，以评估可重复性。如果实验室拥有多套检测系统，需进行检测系统间结果可比性的评估；如果一套检测系统中包含多台扩增仪或扩增模块，需进行扩增仪或模块间结果可比性的评估。重复性或结果可比性应满足检测试剂说明书中声明的要求。

8.1.3检出限(分析灵敏度) 检出限提供对特定靶标分析灵敏度的度量，是指可以准确检测并与阴性样本明确区分的，且在≥95%的重复样本中具有一致性的检测能力。应采用定值标准物质(如国际参考品、国家参考品、厂家参考品)，分别对至少ORF1ab基因和N基因双靶标进行检出限的验证，且验证结果数值应不高于试剂使用说明书声明的检出限。

8.1.4携带或交叉污染率 交叉污染验证的目的是检验核酸提取过程中的防污染能力。通常使用棋盘法，即高拷贝阳性质控品和临床阴性样本交叉放置，按照设备最大提取通量进行验证，计算携带或交叉污染率。

8.2质量控制

共识14：新冠核酸全自动PCR检测系统涉及仪器类别或功能模块多、环节繁杂且易受干扰，实验室在参考生产商说明书进行性能验证的前提下，还应针对部分关键环节设置性能参数，并对这些参数通过定期评审，分析其质量控制的有效性。性能参数包括但不限于加样失败率、移液残留率、机械臂定位误差率、核酸提取效率、基因扩增效率、假阳性率、假阴性率、内标污染率，以对检测系统的全流程质量控制提供保障。

在加样、体系配制和移液环节，需要分析加样失败率、机械臂定位误差率；在核酸提取环节，建议采用生产商推荐方法进行核酸提取效率的评估，适用时可分析提取核酸的纯度、浓度/提取产率、完整性；在基因扩增环节，需要分析整体扩增曲线的荧光值、基线和阈值线状况等，间接评估扩增效率[7]；在防污染环节，需在检测系统内部各区域(如加样区、提取区、体系配制区、加模板区、扩增区等)定期监测“清洁液擦拭”和“紫外线照射”等防核酸/扩增子污染措施的有效性。

共识15：建议对新冠核酸全自动PCR检测系统制定室内质量控制措施，包括标准物质的溯源性、外部室内质控品的选择、批长度等。

8.2.1标准物质的溯源性 生产商需提供使用国家药品标准物质“2019-nCoV核酸检测试剂国家参考品(批号：370099-202001)”进行分析系统正确性验证的报告。

8.2.2外部室内质控品的选择 应设置外部阴、阳性室内质控品监测扩增效率，阳性质控品至少覆盖ORF1ab基因和N基因2个靶序列，其浓度分别为试剂盒各靶点检出限的1～1.5倍；3个阴性质控分别以放置在试剂配制区、样本制备区和扩增检测区监控环境核酸污染的生理盐水/DEPC处理水为质控品。

8.2.3批长度 实验室按照每日或每批次检测的样本量及其检测系统分析性能，设立室内质控批长度。“随机处理式检测系统”按工作组(即人员班次)设置，原则上每组不超过8 h；“批处理式检测系统”按每批(即每反应板)设置。

8.3室间质量评价

共识16：实验室应常态化参加国家级或省级临床检验中心组织的新冠病毒核酸检测室间质量评价。不按要求参加室间质评或室间质评结果不合格，不得开展检测。对检测量大以及承担重点人群筛查等任务的实验室，要适当增加室间质评的频率。

室间质评计划应针对灵敏度、特异性和重复性等关键性能指标选择质控品组合进行评价，100%符合为合格。

9 检验后过程

9.1质控分析

共识17：同常规新冠核酸检测系统，新冠核酸全自动PCR检测系统也应该高度重视基线和阈值线的调整，内标质控以及外部阴、阳质控品的分析和判断。

9.1.1内、外部质控 内部(内标)质控可监控从采样、提取到扩增的整个检测过程，对采样质量、样本保存和运输情况以及实验操作是否规范进行总体分析。使用新冠核酸全自动PCR检测系统的实验室应重视内、外部质控的状况，全流程自动化虽可有效避免人工操作造成的随机误差，但吸取、移液、加样、贴膜和转板等机械系统的系统误差需要通过内标曲线分析和阳性外部质控品的连续监测得到更好的监控。

9.1.2外部质控判断规则 弱阳性质控品测定为阳性，阴性质控品全部测定为阴性，视为“在控”；反之，则为“失控”。如阳性质控“失控”，则应对所有阴性样本进行重新检测；如阴性质控“失控”，则应对所有阳性样本进行重新检测。

9.2结果分析

共识18：新冠核酸全自动PCR检测系统的结果判读规则应在实验室性能验证满足要求的基础上，参照检测试剂说明书进行。通常半自动或人工操作时会对一些“翘尾”或“异常曲线”通过基线和/或阈值线的微调整进行进一步分析，新冠核酸全自动PCR检测系统如为自动化判读模式，实验室应当谨慎对待这些“翘尾”或“异常曲线”的结果判定，必要时转换为手动模式进行人工判读。

封膜或封盖后反应体系的气泡和液面监测及预警是目前新冠核酸全自动PCR检测系统亟需解决的技术难点之一，上述情况可能会引起灰区范围内出现异常曲线，导致假阳性结果。实验室应在性能验证基础上，结合本实验室全自动PCR检测系统的技术特点和日常积累的实践经验做出综合判断，降低结果错报的风险。

9.3结果审核及报告

共识19：新冠核酸全自动PCR检测系统的结果报告规则，应同常规新冠核酸检测系统一致，无论系统是否设置自动报告程序，均需要经人工判断和审核后报告，必要时要对仪器自动设置的阈值线依据试剂盒阴阳性对照的扩增曲线作手动调整。单靶扩增和/或Ct灰区“阳性”必须启用实验室复检规则，符合试剂盒说明书判断规则后方能报告。

共识20：新冠核酸全自动PCR检测系统应充分发挥信息化、智能化和人性化的优势，提高检测效率，缩短报告时间，降低生物安全风险。

新冠核酸全自动PCR检测系统可以通过与LIS对接做到结果回传，避免了传统工作流程中人工核对易发生错误的环节，提高工作效率，加快检测速度和报告时间；可以实现操作人员在非实验室区域通过网络客户端对仪器和软件进行远程共享控制，完成实时查看实验进度、分析实验结果、传输实验数据等操作，降低生物安全风险；可设置样本管理、信息追踪等功能，与新冠结果上报系统、数据分析系统进行无缝对接，减少人员工作量。

执笔：赵建华、何军、夏欣一、王琳、杨传坤、杨阳、李世宝

共识倡议、终审：许斌

参与本共识修订的人员及单位(按姓氏汉语拼音顺序排列)：

何军(苏州大学附属第一医院)、胡伟锋(郑州安图生物工程股份有限公司)、李世宝(徐州医科大学附属医院)、林晓成(厦门安普利生物工程有限公司)、陆根生(江苏硕世生物科技股份有限公司)、汪俊军(中国人民解放军东部战区总医院)、吴国球(东南大学附属中大医院)、王琳(苏州市独墅湖医院)、王卫萍(中国人民解放军东部战区总医院)、夏欣一(中国人民解放军东部战区总医院)、徐婷(江苏省人民医院)、俞杨(南京市第一医院)、杨阳(中国人民解放军东部战区总医院)、杨传坤(东南大学附属中大医院)、赵建华(江苏省临床检验中心)。

志谢：感谢江苏硕世生物科技股份有限公司、厦门安普利生物工程有限公司、郑州安图生物工程股份有限公司提供技术支持。

利益冲突：作者均声明与志谢厂家不存在利益冲突。