细胞角蛋白18片段M65和表皮生长因子样结构域蛋白7在结直肠癌患者中的表达及临床价值*

范国红，杨鸿林，陆赵阳，沈昊，曹季军，凌伟，刘松良，李勇

(1.苏州市第九人民医院检验科，江苏苏州 215200；2.太仓市第一人民医院检验科，江苏太仓 215400)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是原发于结肠黏膜上皮的恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处[1]。尽管近年来手术方式及药物辅助治疗方法不断改进，并且通过肠镜检查以及血清学筛查指标，可实现一定程度的早期诊断，但是效果并不显著，敏感性和特异性不高。

细胞角蛋白18(cytokeratin 18, CK18)是Ⅰ型细胞角蛋白的重要成员，其表达与肝癌、病毒性肝炎等肝病具有显著相关性，并且在细胞凋亡过程中具有重要的调控作用[2-3]。CK18包括多个片段，M65是其中之一，可作为反映细胞坏死后释放进入血液的CK18的总量指标，CK18及其片段产物的表达在CRC诊断以及药物动力学分析中具有重要的临床价值[4]。

表皮生长因子样结构域蛋白7(epidermal growth factor-like protein 7, EGFL7)属于EGFL家族成员，可以激活胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、核因子κB、促分裂活化的蛋白激酶、蛋白激酶B和Notch等重要信号转导通路，广泛参与多种肿瘤的发生、发展过程[5]。EGFL7在人类肿瘤组织中高表达，包括肾癌、恶性胶质瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌和CRC等，并与患者临床病理特征密切相关[6]。值得注意的是，肝癌、肺癌及卵巢癌等恶性肿瘤患者血清中的EGFL7水平明显升高，尤其以肝癌患者血清EGFL7水平升高最明显，较正常人群升高近4倍[7]，但其在CRC患者血清中的表达尚无报道。本研究旨在观察M65和EGFL7在CRC血清中的表达，并探讨其在CRC发生发展中的诊断价值及预后判断价值。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2019年3月至2021年7月经苏州市第九人民医院病理科、太仓市第一人民医院病理科初诊确诊的CRC患者46例，年龄38～84岁，男28例，女18例。纳入标准：(1)病理确诊为CRC；(2)术前未进行过任何治疗，无其他肿瘤史，且临床病理及随访信息均齐全；(3)排除其他系统疾病。根据1997年国际抗癌联盟制定的TNM分期系统对CRC进行病理分期。以同期43例经肠镜检查获得病变组织的非肿瘤肠道疾病(包括肠道息肉、肠炎等)确诊患者(年龄30～84岁，男27名，女16名)的血清标本作为疾病对照。本研究经太仓市第一人民医院医学伦理委员会批准(批准文号：2021-KY-124)，研究对象均知情同意。

1.2血清标本收集 采集所有研究对象清晨空腹静脉血2 mL，置于含促凝剂和分离胶的真空采集管中，室温下3 000×g离心15 min后吸取血清，置于-80 ℃冰箱冻存待测。

1.3ELISA检测 使用中国和锐公司试剂盒，采用ELISA方法检测M65的表达水平，按试剂盒说明书进行操作。使用Abcam公司试剂盒，采用ELISA方法检测EGFL7的表达水平，按试剂盒说明书进行操作。

1.4Ki67免疫组化检测 将包埋好的CRC组织切成4 μm切片，70 ℃烘烤1 h后经二甲苯和梯度乙醇脱水，置于柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复，然后将切片置于3% H2O2溶液中去除内源性辣根过氧化物酶(HRP)，BSA封闭后加抗Ki67一抗(北京中杉金桥公司)37 ℃温育1 h，清洗后用HRP标记的二抗(北京中杉金桥公司)，室温温育30 min，最后DAB显色后苏木素衬染，中性树胶封片后显微镜观察。Ki67染色结果经有经验的病理医生读片后判断阳性指数。

2 结果

2.1CRC患者及对照患者血清M65、EGFL7表达水平比较 CRC患者血清的M65表达水平为215.7(152.5，287.8)U/L，而对照组为125.7(111.0，142.1)U/L，Mann-WhitneyU检验显示两组间血清M65浓度差异有统计学意义(U=290.5，P<0.000 1)。CRC患者血清EGFL7的浓度为1.814(1.209，2.537)pg/mL，而对照组为1.193(1.025，1.464)pg/mL，Mann-WhitneyU检验分析显示两组间血清EGFL7浓度差异有统计学意义(U=599，P=0.001 2)。

2.2血清中M65、EGFL7联合检测在CRC中的诊断价值分析 通过ROC曲线分析，得到当M65作为区分CRC患者和对照患者的诊断指标时，曲线下面积(area under curve，AUC)为0.853 1(95%CI：0.771 4～0.934 9)，cut off值为146.8 U/L时，敏感性为78.26%，特异性为83.72%。EGFL7作为区分CRC患者和对照患者的诊断指标时，AUC为0.697 2(95%CI：0.585 8～0.808 5)，cut off值为1.480 pg/mL时，敏感性为67.39%，特异性为76.74%。二者联合诊断时AUC为0.909 0(95%CI：0.845 6～0.972 4)，敏感性和特异性分别为86.96%、81.84%。见图1。

图1 血清中M65、EGFL7联合检测在CRC中的诊断价值

2.3不同临床病理参数CRC患者间血清M65、EGFL7表达水平比较 将M65的表达水平与CRC患者的各临床病理参数通过Mann-WhitneyU检验进行不同分类的比较分析，结果显示，瘤体大小≥5 cm患者M65浓度高于瘤体大小<5 cm患者，差异有统计学意义(P=0.038)；而不同肿瘤大小、TNM分期以及淋巴结转移情况的患者间EGFL7水平差异均有统计学意义(P=0.009、0.005、0.021)。见表1。

表1 CRC患者各病理特征分类下的M65、EGFL7检测结果

2.4CRC患者血清M65、EGFL7表达水平与肿瘤细胞增殖能力的相关性 46例CRC患者的肿瘤组织Ki67表达百分比为10%的1例，20%的2例，30%的5例，40%的2例，50%的2例，60%的7例，70%的5例，80%的12例，90%的10例。见图2。将M65的表达水平与肿瘤细胞的增殖能力进行Pearson相关性分析，结果显示相关性无统计学意义(r=0.277 7，P=0.061 6)，EGFL7与Ki67的表达相关性无统计学意义(r=0.185 2，P=0.218 7)。

图2 肠癌组织Ki67不同程度表达(100×)

3 讨论

本研究结果显示，M65在疾病对照组中表达稳定，而在CRC组的表达明显增高，考虑CRC组与疾病对照组之间的差异有统计学意义，这可能提示CRC进展过程中出现的大量细胞死亡导致细胞角蛋白释放至血液，同时在肿瘤进展过程中还有一些其他因素导致角蛋白片段释放增加、降解减少，这些因素共同导致M65血清浓度的升高。这些可能是M65作为CRC诊断潜在标志物的分子基础。M65与EGFL7的联合检测AUC值可达0.909 0，这与陈文萍在2020年的一项多指标联合检测在大肠癌中的诊断价值研究结果类似[8]，同时这两个标志联合检测的敏感性和特异性也与朱珊玲等的一项4个肿瘤标志物的联合研究结果接近[9]，这些结果都提示M65与EGFL7的联合检测具有很强的潜在CRC诊断价值。

M65表达与肿瘤细胞增殖的相关性虽然未见统计学意义，但r值为0.277 7，P值为0.061 6，提示M65的产生与肿瘤细胞的快速增殖之间可能有一定的正相关性。由于M65是细胞坏死之后释放的，而细胞的快速增殖进而缺氧是导致细胞坏死的主要原因，因此M65的临床价值更多是建立在其与肿瘤细胞增殖、坏死相关，与临床相关的分析显示M65浓度与肿瘤大小显著相关(P=0.038)，与其他因素相关性不显，也进一步证实了这一点。进一步增加样本量可能会得到M65与肿瘤细胞增殖之间更为准确的关系。而EGFL7作为一种血管内皮细胞源性分泌性因子，主要作用在于调节各类细胞(包括内皮细胞、肿瘤细胞等)的黏附、迁徙[10]。本研究结果显示，EGFL7与肿瘤大小、TNM分期以及淋巴结转移都具有显著相关性，而与肿瘤细胞的增殖无显著相关性，提示EGFL7与M65不同，不是通过肿瘤细胞增殖、坏死相关的途径，而可能是通过调控肿瘤细胞迁移、侵袭、转移等途径发挥促肿瘤功能。因此，M65可作为CRC疾病的筛查标志以及肿瘤增殖坏死的标志，而EGFL7的临床价值更偏向作为CRC肿瘤转移与不良预后的预测标志物。

综上所述，血清中M65、EGFL7的浓度在CRC患者中显著升高，二者联合检测可有效诊断CRC。而血清EGFL7水平与患者的临床病理特征的相关性更强，且与患者淋巴结转移与否具有相关性，未来或可用于患者的预后判断及转移评估。本课题的研究病例数量较少，相关推论还需要扩大样本量以及追踪患者的长期随访数据，以进行深入研究。