脓毒症患者免疫功能的研究进展

暴蓉，苗林子，哈斯朝鲁，屈晨雪

(1.山西医科大学第一医院检验科，太原030001；2.北京大学第一医院检验科，北京100034)

脓毒症是宿主对感染的反应失调引起的危及生命的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，可发展为严重脓毒症和脓毒性休克。国内研究显示，我国重症监护病房(intensive care unit，ICU)患者中脓毒症发病率约为20%，90 d病死率为35.5%[1]。近年来，专家学者对脓毒症发病机制的探索也日趋完善，从局限到较为全面，共经历了3个阶段。第一个阶段，全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)概念的提出，主要基于脓毒症是一种感染诱导的全身炎症反应的假设，但这一认知有较为明显的局限性，只关注到了脓毒症始动因素，即感染所致全身炎症，缺乏对脓毒症其他相关和后续病程的了解，这也导致了诊断特异性低，不利于临床诊断和研究；第二个阶段，主要改进是在全身炎症反应之外，关注了相关血液动力学、组织灌注和器官功能状态，但这一认知同样也存在局限性，即对脓毒症的概念仍然停留在临床症状阶段，对其深层次发病机理的研究仍然较为缺乏，无助于提高脓毒症的诊断和治疗效率，同时其复杂性也难以在临床广泛应用；第三个阶段即现阶段，从免疫学角度阐述了脓毒症的发病机理，认为其本质上是严重感染所致的免疫紊乱，包括过度免疫激活和免疫抑制2个关键因素[2]，最终导致患者发生MODS甚至死亡。而且有研究指出，即使是脓毒症幸存者，也存在长期的身体和认知障碍，其死亡率高于一般人群。具体来说，脓毒症幸存者在出院后的第一年内死亡率为15%，在未来5年内每年死亡率为6%～8%[3]。因此，从根本上逆转导致脓毒症患者高死亡率的免疫抑制，成为治疗脓毒症极具创新性和实用性的研究方向，同时还可作为免疫治疗效果评估的重要途径[4]。本文将围绕脓毒症患者的发病机制即免疫功能紊乱，免疫功能评价指标即流式细胞仪检测T、B淋巴细胞数量和功能及细胞因子，和临床治疗中的免疫增强与抗炎3个方面来展开论述，期望为临床医生提供治疗脓毒症的免疫学思路和方法。

1 脓毒症患者免疫功能及其紊乱

脓毒症常常表现为大量炎症因子的增加和同时存在的淋巴细胞数量和功能的降低，其病理过程称之为持续的炎症反应和持续的免疫抑制。

1.1炎症反应的循环往复 在大多数情况下，机体免疫功能正常。当有外源性微生物侵入机体或机体发生内源性损伤时，会有对应的2类“警报素”，外源性微生物产物病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)和内源性组织损伤来源的损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)，向机体释放，二者是体内模式识别受体(pattem recognition receptors, PRRs)的配体[5]，引起炎症反应，用于消除体内“异己”，抗炎和促炎处于动态平衡。但是在发生脓毒症时，机体固有免疫和适应性免疫都不同程度出现了细胞数量减少和免疫功能下降的特征，例如中性粒细胞迁移能力减弱，树突状细胞数量减少和抗原提呈能力下降，诱导T细胞免疫应答能力减弱等，这些因素共同导致了外来病原体清除能力下降，病原菌不能被完全清除，持续低水平向体内释放“警报素”，接连不断的外来刺激又使M1型巨噬细胞释放过量的促炎细胞因子，如IL家族成员(IL-1、IL-3、IL-6、IL-8等)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IFN-γ，进一步加重了免疫损伤。如此最终导致炎症诱导的器官损伤和损伤诱导的炎症的持续恶性循环，患者病情持续加重，死亡率增加。慢性炎症所致的器官损伤主要通过诱导线粒体中活性氧产生增加[6]，这种氧化应激导致线粒体功能障碍、氧化损伤和细胞代谢能量不足，进一步加重炎症和细胞死亡。炎症导致的肾脏和肌肉损伤则导致这些组织中进一步释放内源性DAMPs，机体进入下一个炎症循环[7]。脓毒症患者长期处于炎症状态，免疫细胞和免疫组织消耗殆尽，机体免疫功能严重紊乱，免疫反应进入抑制阶段。

1.2多因素所致的免疫抑制

1.2.1免疫细胞数量减少 持续存在的炎症反应使免疫细胞损耗增加，同时脓毒症本身也会发生骨髓抑制现象，使免疫细胞数量减少，主要表现为急性淋巴细胞数量减少，淋巴细胞计数持续低于1.0×109/L，高度提示患者免疫抑制状态，预后不良[8]。树突状细胞、NK细胞和T细胞在免疫紊乱过程中都表现为对抗原刺激呈持续低反应状态[9]。

1.2.2免疫细胞功能异常 除树突状细胞抗原提呈能力下降，单核/巨噬细胞和T淋巴细胞也有不同程度的功能改变。单核细胞活化标志膜HLA-DR(mHLA-DR)表达减少，导致刺激T细胞和B细胞完全活化的共刺激信号减弱；单核/巨噬细胞释放的促炎因子如TNF-α和IL-12明显减少，发挥免疫抑制作用的抗炎因子IL-10明显增多。Th细胞分化为Th2型明显增多，Th2细胞分泌抑制性细胞因子IL-4、IL-13和IL-10，抑制巨噬细胞和白细胞的活化和增殖，抑制炎症反应，免疫功能表现为抑制状态，Th1/Th2比例失调的严重程度与疾病的预后相关[10]。Treg异常升高伴随Th17/Treg比例倒置，也提示免疫抑制发生。Th17细胞主要产生IL-17、IL-6和IL-22，募集、激活和趋化中性粒细胞至炎症感染部位，消除病原体并介导炎症反应；Treg细胞促进T细胞凋亡，发挥免疫抑制作用。

1.2.3抑制性免疫检查点表达增强 抑制性免疫检查点为近年来肿瘤免疫治疗的热点，拮抗抑制性免疫检查点，提升患者免疫功能，增强机体抗肿瘤、抗感染的能力，也日渐在脓毒症治疗方面受到关注，为解决脓毒症患者的免疫抑制甚至“免疫瘫痪”提供了新的思路。抑制性免疫检查点是白细胞表面特定的检查点蛋白，包括程序性细胞死亡受体1(programmed death receptor-1, PD-1)、程序性细胞死亡受体配体1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)、程序性细胞死亡受体配体2(programmed cell death-ligand 2, PD-L2)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(B- and T-lymphocyte attenuator, BTLA)、淋巴细胞激活基因-3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)和T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3, TIM-3)和2B4，其主要作用是限制免疫系统过度激活和维持内环境稳态。免疫检查点受体主要位于T淋巴细胞上，通过识别抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上的互补配体来发挥作用。脓毒症患者T淋巴细胞上免疫检查点受体表达增加，通过抑制白细胞杀菌功能来促进败血症诱导的免疫抑制[11]。封锁免疫检查点的治疗方法在逆转脓毒症诱导的免疫抑制和保持机体免疫力，对抗原发性和继发性感染方面具有显著作用[3]。下面是常见抑制性免疫检查点在脓毒症中的运用。

1.2.3.1PD-1和PD-L1/PD-L2 脓毒症时PD-1在T细胞上表达增加，两者相互作用产生抑制信号来减弱T细胞的反应，导致T细胞耗竭[12]。T淋巴细胞在体内发挥重要的细胞免疫作用，T细胞耗竭与病原体清除受损、多器官损伤和死亡率增加有关。PD-1/PD-L1除了损害淋巴细胞，对髓细胞也有抑制作用。在脓毒症患者中，中性粒细胞和单核细胞上PD-L1表达的增加与其吞噬能力的下降相关，脓毒症休克恢复期(第7天)患者PD-1表达恢复正常[13]。

1.2.3.2CTLA-4和CD80/CD86 脓毒症患者的T细胞上CTLA-4(CD152)的表达呈时间依赖性的进行性增加，CTLA-4信号可加强APCs的内吞作用，使CD80和CD86在APCs细胞表面表达减少，由于CD80和CD8同时是介导T细胞激活的共刺激受体CD28的配体，所以CTLA-4是T细胞效应功能的负性调控因子，而且其增加也与T细胞的凋亡增加有关[14]。最近有研究指出，特异性CTLA-4单核苷酸多态性的存在可能有利于缓解CTLA-4介导的T细胞衰竭，例如CTLA-4基因中存在rs3087243 G等位基因的脓毒症患者，其28 d和90 d死亡风险较低[15],这一发现也从基因水平揭示了脓毒症发病机制的异质性。

1.2.3.3BTLA和疱疹病毒侵入介质(herpesvirus entry mediator，HVEM) BTLA(CD272)和HVEM的结合主要抑制TCR信号介导的效应功能，包括T细胞的激活和增殖[16]。脓毒症时，靶向BTLA可以同时激活固有免疫和适应性免疫[3]。同时可溶性BTLA(sBTLA)也是脓毒症较好的预后标志物，血浆中sBTLA水平高于21 ng/mL，预示着脓毒症患者的死亡率增加5倍[17]，需要注意的是运用抗BTLA抗体应密切关注使用剂量和使用时间。

1.2.3.42B4/CD48 CD48表达在APC上，是已知2B4(CD244)的配体。2B4特异性介导记忆T细胞的丢失，而2B4的缺失可减弱记忆T细胞的丢失，从而提高脓毒症患者的生存率[18]，同时敲除2B4还可以防止脓毒症诱导的抗原特异性CD8+T细胞的丢失，并减轻脓毒症后增加的病毒载量，同时使PD-1表达也降低[19]。可见阻断2B4通路可同时阻断其他一些共抑制受体，保存T淋巴细胞的功能。

2 脓毒症患者免疫功能的检测

2.1流式细胞仪的临床运用 从多色流式细胞术到光谱流式细胞术，流式细胞术的发展具备了更好的清晰度和更多色的荧光素，是临床工作中首选的单个细胞分析技术[20]。流式细胞术的运行效率达到每秒10万事件，通过免疫学原理结合被分析细胞的标记特征(如表面抗原、胞浆抗原、核抗原和DNA)，可从成千上万个细胞中快速识别异常细胞，量化特定细胞的增多或减少，为监测患者病情变化提供动态监测指标。流式细胞仪跟踪特定细胞数量的变化，可为临床辅助诊断相关癌症(如白血病的免疫分型)、炎症(炎症因子的释放)或免疫抑制(淋巴细胞的数量和功能)及各种综合征(如阵发性睡眠性血红蛋白尿)提供参考。流式细胞技术在我国已广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤及细胞治疗等多个领域，在评价免疫功能方面，流式细胞术也取得了显著的成效。目前，流式细胞仪检测淋巴细胞亚群和细胞因子，在临床得到了广泛的开展与认可。其一，通过动态监测T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK淋巴细胞的数量变化，可初步掌握患者的全身免疫功能状态；其二，由于T淋巴细胞在体内主要执行细胞免疫的功能，其中CD4+T细胞为辅助性T细胞，CD8+T细胞为杀伤性T细胞，当CD4+/CD8+比值降低时，提示患者发生感染的风险增加，预后不良；其三，不同的细胞因子在体内分别发挥促炎和抗炎的作用，通过检测促炎因子(如TNF-α、IL-6和IL-8)和抗炎因子(如IL-4、IL-10和IL-13)的含量，有效避免脓毒症患者免疫抑制的发生。

2.2免疫功能检测指标 除临床普遍开展的淋巴细胞亚群即T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK淋巴细胞的检测，在流式细胞仪上通过增加荧光抗体，还可将T淋巴细胞和B淋巴细胞细分为25个亚类。具体检测指标包括T淋巴细胞亚类：CD4+T细胞、纯真CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、CD8+T细胞、纯真CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、效应CD8+T细胞、CD8+/CD28+、CD8+/CD28-、CD4+/HLA-DR+、CD8+/HLA-DR+、Th1、Th2、Th9、Th17、Treg；B淋巴细胞亚类：浆母细胞、浆细胞、过渡B细胞、纯真B细胞、类别B细胞、未类别B细胞。同时细胞因子的检测也发挥了重要的作用，包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、IFN-α2和IFN-γ。流式细胞仪检测细胞因子为临床评价体内炎症和免疫状态提供了有效手段，检测原理是基于免疫学的“夹心法”[21]，即荧光微球偶联的细胞因子抗体与生物素标记的因子抗体配体和标本中的细胞因子结合形成“夹心”，在荧光素的标记下进行检测。脓毒症具有炎症因子风暴和免疫抑制的特点，脓毒症患者中IL-1β水平死亡组明显高于存活组[22]；IL-2大量分泌将激活3种主要的信号通路，包括JAK-STAT通路、RAS-MAP激酶通路和PI3/AKT通路，导致免疫反应失控[23]；IL-6增加血管通透性，利于炎症扩散，脓毒症幸存者中含量明显下降，而在死亡组则维持较高的水平[24]；大量炎症因子释放过后，抑制性抗炎因子又在体内持续增高，严重影响机体免疫功能的恢复，导致脓毒症患者免疫功能失调、多脏器损伤甚至死亡。

3 基于脓毒症患者免疫功能紊乱的免疫学干预策略

目前，脓毒症的治疗主要采用的是抗菌药物、液体置换和器官支持性治疗等，但都存在着一些弊端，治疗效果也不尽如人意。例如抗菌药物的耐药现象愈演愈烈和器官支持性治疗只能降低脓毒症患者在院死亡率，出院后1年内死亡率仍然居高不下。针对自身免疫抑制和持续不断的炎症刺激，运用免疫激活剂和炎症抑制剂促使脓毒症患者免疫功能恢复，将是脓毒症未来治疗关注的重点。

3.1促进免疫细胞的增殖和分化

3.1.1粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) GM-CSF是一种造血刺激因子，可刺激多种免疫细胞的增殖和分化，诱导髓系干细胞分化成为成熟粒细胞，增强中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用和抗菌活性[25]，提高免疫细胞功能，上调mHLA-DR表达。以WBC或mHLA-DR为导向的GM-CSF的治疗可能改善脓毒症患者的预后，但剂量和疗程需得到更多的研究验证[26]。

3.1.2IL-7 IL-7在骨髓和胸腺中产生，为T细胞成熟和存活所必需。IL-7可以减少淋巴细胞凋亡，诱导T细胞增殖，增加IFN-γ、抗PD-L1抗体、粒细胞集落刺激因子和GM-CSF等，促进白细胞向感染部位迁移，提高存活率[27]，重组人IL-7(CYT107)在增加淋巴细胞数量的同时还不会导致过度的炎症反应和器官功能损害，可有效调理免疫抑制[28]。

3.1.3胸腺肽α1(thymosin α1, Tα1) Tα1是一种由胸腺等器官分泌的内源性肽，是一种天然的小分子物质，可以激活树突状细胞，提高NK细胞活性，直接增强巨噬细胞介导的吞噬和抗菌作用，上调单核细胞活化标志HLA-DR和抑制PD-L1表达，达到协同增强免疫功能的目的，同时还可增加T细胞数量和活性，主要增强Th1细胞的抗菌活性[29]。

3.1.4抗PD-L1抗体/PD-1抗体 阻断PD-1/PD-L1通路，恢复T细胞功能，在肿瘤免疫治疗中已取得了一定成果。鉴于脓毒症和肿瘤在免疫抑制方面的相似性，目前也有实验表明，脓毒症患者淋巴细胞计数小于1.0×109/L，即处于免疫抑制状态时，运用抗PD-L1抗体和抗PD-1抗体高剂量治疗(300～900 mg)，可显著上调单核细胞的HLA-DR，并维持增加超过28 d，与此同时促炎细胞因子(如IL-6、IL-8或IL-10)的水平并没有升高[30]，其有效性和安全性得到初步的证实。

3.2抑制体内炎症反应的过度发生 从脓毒症的发病机制来看，注重恢复患者免疫功能的同时，抑制持续的炎症反应也是另一种重要的治疗途径。糖皮质激素通过下调控制炎症反应发生的基因(包括NF-κB和AP-1)来达到抑制固有免疫反应的目的[31]。氢化可的松联合氟氢可的松可降低脓毒症患者90 d死亡率[32]。在近期一项对新型冠状病毒肺炎重症患者治疗的研究中发现，抗IL-6受体抗体(托珠单抗)可结合膜或可溶性IL-6受体，达到阻断下游炎症信号转导，改善预后的目的[33]，同时联合糖皮质激素，将得到更大的益处[34]。但是使用细胞因子拮抗剂要注意时间节点，在感染的早期阶段炎症因子可以促进免疫功能的正常发挥，起到控制感染的作用，只有炎症反应失调持续存在并出现损伤时使用，可以抑制持续的免疫反应。乌司他丁作为体内天然的抗炎物质，可抑制炎症介质的产生和释放，增加抗炎因子IL-10水平[35]，促进促炎反应和抗炎反应之间的平衡，从而阻断炎症反应恶性循环导致的细胞因子风暴，保护血管内皮，可用于治疗脓毒症相关的急性循环衰竭，联合Tα1可缩短机械通气持续时间，改进28 d生存率[36]。高剂量的乌司他丁具有与糖皮质激素相同的抗炎作用，但不会产生免疫抑制，具有比糖皮质激素更小的副作用。

4 结论

脓毒症患者免疫功能状态直接影响临床治疗措施和患者的预后。因此，动态监测脓毒症患者的免疫功能变化，重点关注免疫细胞数量和功能的改变及细胞因子的释放，发现更为有效和便捷的免疫功能预测标志物，及时采取有效的治疗措施，通过免疫治疗提高免疫细胞数量和改善免疫系统功能，同时联合抗炎抗感染、液体置换和器官支持治疗，将会给脓毒症患者带来新的治疗希望。