miR-92a-3p靶向同源盒蛋白13对高糖诱导的肾小球系膜细胞损伤的影响

苏珊珊 刘慧 修方睿 王冬燕

山东省中医院肾病科（济南 250011）

体内持续的高糖环境可促进肾小球系膜细胞损伤，并可引起氧化应激、炎症反应及诱导细胞凋亡进而促进糖尿病肾病的发生及发展[1-2]。微RNA（miRNA）是一种小的非编码RNA（长度约22个核苷酸），参与细胞增殖和凋亡等生物过程[3-4]。据报道，miRNA在糖尿病肾病中表达异常，可调控肾小球系膜细胞增殖及凋亡等生物学行为[5-6]，是糖尿病肾病潜在的治疗靶点。研究[7]显示，miR-92a-3p在肾脏组织损伤中表达水平升高，抑制其表达可减轻肾组织损伤。但miR-92a-3p在糖尿病肾病中的作用尚不清楚。TargetScan预测显示miR-92a-3p与同源盒蛋白 13（Homeobox protein 13，HOXA13）存在结合位点。研究[8]表明HOXA13在高糖诱导的肾小球系膜细胞中表达下调。miR-92a-3p是否能通过调控HOXA13参与糖尿病肾病的进展鲜有报道。因此，本研究旨在探讨miR-92a-3p是否可通过靶向调控HOXA13的表达而参与高糖诱导的肾小球系膜细胞损伤过程。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂美国ATCC公司提供小鼠肾小球系膜细胞SV40-MES-13；美国Gibco提供DMEM培养液与胎牛血清；北京全式金生物公司提供Trizol试剂；美国Thermo Fisher公司提供Lipofectamine2000、cDNA合成及qRT-PCR试剂；上海吉玛制药技术有限公司提供anti-miR-NC、anti-miR-92a-3p、pcDNA、pcDNA-HOXA13、miR-NC、miR-92a-3p mimics、si-NC、si-HOXA13；北京索莱宝公司提供细胞凋亡检测试剂盒与双荧光素酶活性检测试剂盒；美国Promega公司提供双荧光素酶报告基因载体；英国Abcam公司提供兔抗鼠HOXA13抗体；美国CST公司提供兔抗鼠Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-12抗体；武汉博士德生物公司提供HRP标记的山羊抗兔IgG二抗。

1.2 方法

1.2.1 实验分组取对数生长期SV40-MES-13细胞接种于6孔板（1×104个/孔），分为对照组（正常培养的SV40-MES-13细胞）、高糖组（用含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基处理细胞 24 h[9]）、anti-miR-NC+高糖组（anti-miR-NC转染SV40-MES-13细胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基处理细胞24 h）、anti-miR-92a-3p+高糖组（anti-miR-92a-3转染SV40-MES-13细胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基处理细胞24 h）、pcDNA+高糖组（pcDNA转染SV40-MES-13细胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基处理细胞24 h）、pcDNA-HOXA13+高糖组（pcDNAHOXA13转染SV40-MES-13细胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基处理细胞24 h）、anti-miR-92a-3p+si-NC+高糖组（anti-miR-92a-3p和si-NC共转染SV40-MES-13细胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基处理细胞24 h）、anti-miR-92a-3p+si-HOXA13+高糖组（anti-miR-92a-3p和si-HOXA13共转染SV40-MES-13细胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基处理细胞24 h），采用Lipofectamine2000进行转染。

1.2.2 qRT-PCR检测miR-92a-3p、HOXA13mRNA的表达水平采用Trizol试剂提取SV40-MES-13细胞总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，应用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪检测miR-92a-3p、HOXA13 mRNA相对表达量。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率各组SV40-MES-13细胞加入预冷PBS洗涤后弃上清，按照凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.4 双荧光素酶报告实验检测miR-92a-3p与HOXA13的靶向关系HOXA13-3'UTR-WT/miRNC、HOXA13-3'UTR-MUT/miR-NC、HOXA13-3'UTR-WT/miR-92a-3p mimics、HOXA13-3'UTR-MUT/miR-92a-3p mimics分别共转染至SV40-MES-13细胞，于培养箱内继续培养24 h后检测细胞荧光素酶活性。采用脂质体转染法将miR-NC、miR-92a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-92a-3p分别转染至SV40-MES-13细胞，转染48 h后收集细胞，采用Western blot法检测HOXA13蛋白水平。

1.2.5 Western blot检测 HOXA13、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspas e-12蛋白表达量收集各组SV40-MES-13细胞加入500 μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，每孔道加入30 μg蛋白进行SDS-PAGE、转膜，5%脱脂牛奶封闭 2 h，加入 HOXA13（1∶800）、Cleaved-caspase-3（1∶800）、Cleaved-caspase-12（1∶800）一抗与内参β-actin抗体（1∶3 000）稀释液，4℃孵育过夜，加入二抗稀释液（1∶5 000）37℃ 孵育2 h，用Quantity One软件对蛋白条带进行定量。

1.3 统计学分析采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料以（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖对肾小球系膜细胞miR-92a-3p和HOXA13表达的影响与对照组比较，高糖组miR-92a-3p的表达量升高（P＜0.05），HOXA13 mRNA及蛋白水平降低（P＜ 0.05），见图1、表1。

图1 Western blot检测HOXA13的蛋白表达量Fig.1 Western blot detection of HOXA13 protein expression

表1 高糖对肾小球系膜细胞miR-92a-3p和HOXA13表达的影响Tab.1 Effects of high glucose on the expression of miR-92a-3p and HOXA13 in glomerular mesangial cells ±s

表1 高糖对肾小球系膜细胞miR-92a-3p和HOXA13表达的影响Tab.1 Effects of high glucose on the expression of miR-92a-3p and HOXA13 in glomerular mesangial cells ±s

组别对照组高糖组t值P值miR-92a-3p 1.00±0.11 2.43±0.21 18.096＜0.001 HOXA13 mRNA 1.00±0.10 0.43±0.04 15.877＜0.001 HOXA13蛋白0.82±0.08 0.34±0.03 16.854＜0.001

2.2 anti-miR-92a-3p对高糖介导的肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡的影响与对照组比较，高糖组细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白水平升高（P＜0.05）；与anti-miR-NC+高糖组比较，anti-miR-92a-3p+高糖组细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白水平降低（P＜0.05），见图2、表2。

图2 过表达miR-92a-3p对高糖介导的肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡和相关蛋白表达的影响Fig.2 Effect of overexpression of miR-92a-3p on apoptosis and related protein expression of high glucose mediated glomerular mesangial cell SV40-MES-13

表2 高糖对肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡的影响Tab.2 Effect of high glucose on apoptosis of glomerular mesangial cells SV40-MES-13 ±s

表2 高糖对肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡的影响Tab.2 Effect of high glucose on apoptosis of glomerular mesangial cells SV40-MES-13 ±s

注：与对照组比较，*P＜0.05；与高糖组比较，#P＜0.05

组别对照组高糖组anti-miR-NC+高糖组anti-miR-92a-3p+高糖组F值P值miR-92a-3p 1.00±0.11 2.43±0.21*2.41±0.19 1.19±0.09#381.478＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.31±0.03 0.79±0.07*0.78±0.06 0.38±0.03#228.466＜0.001 Cleaved-caspase-12 0.32±0.03 0.73±0.07*0.71±0.06 0.34±0.03#177.670＜0.001细胞凋亡率（%）6.79±0.53 21.05±1.93*20.93±1.83 7.98±0.71#283.725＜0.001

2.3 miR-92a-3p靶向HOXA13，调控HOXA13的表达miR-92a-3p与HOXA13存在结合位点，见图3A。miR-92a-3p过表达可抑制野生型载体HOXA13-3'UTR-WT的荧光素酶活性（P＜0.05），见表3。miR-92a-3p可负向调控HOXA13的表达，见表4。

图3 miR-92a-3p靶向HOXA13，调控HOXA13的表达Fig.3 miR-92a-3p targets HOXA13 and regulates HOXA13 expression

表3 双荧光素酶活性检测Tab.3 Double luciferase activity test ±s

表3 双荧光素酶活性检测Tab.3 Double luciferase activity test ±s

组别miR-NC miR-92a-3p t值P值荧光素酶活性HOXA13-3'UTR-WT 1.00±0.10 0.39±0.03 17.528＜0.001 HOXA13-3'UTR-MUT 1.00±0.11 1.02±0.09 0.422 0.679

表4 Western Blot检测HOXA13蛋白的表达Tab.4 Western Blot detection of HOXA13 protein expression ±s

表4 Western Blot检测HOXA13蛋白的表达Tab.4 Western Blot detection of HOXA13 protein expression ±s

组别miR-NC miR-92a-3p anti-miR-NC anti-miR-92a-3p F值P值HOXA13 0.83±0.08 0.40±0.04*0.81±0.07 1.23±0.10#180.616＜0.001

2.4 HOXA13对高糖介导的肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡的影响与pcDNA+高糖组比较，pcDNA-HOXA13+高糖组细胞凋亡率和Cleavedcaspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白水平降低（P＜0.05），见图4、表5。

图4 HOXA13对高糖介导的肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡和相关蛋白表达的影响Fig.4 Effect of HOXA13 on apoptosis and related protein expression of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13

表5 HOXA13对高糖介导的肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡的影响Tab.5 Effect of HOXA13 on apoptosis of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13±s

表5 HOXA13对高糖介导的肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡的影响Tab.5 Effect of HOXA13 on apoptosis of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13±s

组别pcDNA+高糖组pcDNA-HOXA13+高糖组t值P值HOXA13 0.35±0.03 0.87±0.08 18.258＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.81±0.07 0.41±0.03 15.757＜0.001 Cleaved-caspase-12 0.75±0.07 0.34±0.03 16.151＜0.001细胞凋亡率（%）21.15±2.03 8.36±0.63 18.052＜0.001

2.5 si-HOXA13可以逆转anti-miR-92a-3p对高糖介导肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡的影响与anti-miR-92a-3p+si-NC+高糖组比较，antimiR-92a-3p+si-HOXA13+高糖组细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白水平升高（P＜ 0.05），见图5、表6。

图5 si-HOXA13可以逆转anti-miR-92a-3p对高糖介导肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡和相关蛋白表达的影响Fig.5 si-HOXA13 can reverse the effect of anti-miR-92a-3p on apoptosis and related protein expression of high glucose mediated glomerular mesangial cell SV40-MES-13

表6 si-HOXA13可以逆转anti-miR-92a-3p对高糖介导肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡和内质网应激的影响Tab.6 si-HOXA13 can reverse the effect of anti-miR-92a-3p on apoptosis and endoplasmic reticulum stress of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13 ±s

表6 si-HOXA13可以逆转anti-miR-92a-3p对高糖介导肾小球系膜细胞SV40-MES-13凋亡和内质网应激的影响Tab.6 si-HOXA13 can reverse the effect of anti-miR-92a-3p on apoptosis and endoplasmic reticulum stress of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13 ±s

组别anti-miR-92a-3p+si-NC+高糖组anti-miR-92a-3p+si-HOXA13+高糖组t值P值HOXA13 0.79±0.07 0.34±0.03 17.726＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.37±0.03 0.75±0.06 16.994＜0.001 Cleaved-caspase-12 0.33±0.03 0.73±0.07 15.757＜0.001细胞凋亡率（%）7.89±0.63 19.13±1.52 20.494＜0.001

3 讨论

miRNA异常表达可参与糖尿病肾病发生及发展过程，并可调节肾小球系膜细胞增殖及凋亡。研究表明 miR-206[10]、miR-485[11]、miR-17-5p[12]等miRNA在糖尿病肾病中表达异常。本研究结果表明，在高糖诱导的肾小球系膜细胞中miR-92a-3p的表达量升高，下调miR-92a-3p表达可减少肾小球系膜细胞凋亡，并降低Cleaved-caspase-3、Cleavedcaspase-12蛋白水平；表明敲低miR-92a-3p可抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡。此外，miR-92a-3p可靶向负调控HOXA13表达，抑制HOXA13表达可减弱miR-92a-3p敲低对高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡的抑制作用，提示敲低miR-92a-3p可能通过靶向上调HOXA13表达来抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡，这有助于糖尿病肾病的干预治疗。

最初发现miR-92a-3p在多种人类癌症中高度表达，在癌症进展中起着关键作用，如胃癌[13]、乳腺癌[14]和肾癌[15]。近年来研究显示，除癌症外，miR-92a-3p在急性肺损伤中表达上调，抑制其表达可减轻急性肺损伤[16]；在脑微血管内皮细胞损伤[17]、多柔比星诱导的心肌细胞损伤[18]中miR-92a-3p表达水平也升高，并可促进细胞凋亡。然而，miR-92a-3p在糖尿病肾病中的功能和分子机制尚不清楚。WIESE等[7]发现，miR-92a-3p在肾损伤中呈高表达，抑制miR-92a-3p对肾组织损伤具有保护作用。在本研究中，在高糖诱导的肾小球系膜细胞中 miR-92a-3p水平升高，这与WIESE等[7]研究一致，提示miR-92a-3p可能参与糖尿病肾病的发生和发展。为了验证此推测，本研究采用高糖诱导建立肾小球系膜细胞损伤模型，并利用antimiR-92a-3p转染以敲低miR-92a-3p表达，结果显示，高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡能力升高，与既往研究[19]报道结果相似，敲低miR-92a-3p可减少高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡，并降低Cleavedcaspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白表达，提示敲低miR-92a-3p可抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡。

miRNA通过与mRNA的3'非翻译区（UTR）互补序列的碱基配对，在转录后水平上调节基因表达[20-21]。HOXA13广泛分布于组织器官中，其表达水平异常与肿瘤[22-23]、肾损伤等[8]疾病密切相关。研究表明HOXA13在缺血诱导的神经元中表达下调，上调其表达可抑制神经元凋亡[24]。HOXA13在慢性心力衰竭患者中表达下调，上调其表达可抑制人心肌细胞凋亡及促进细胞增殖[25]。本研究结果显示，高糖诱导的肾小球系膜细胞中HOXA13表达水平降低，HOXA13过表达可抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡。生物信息学预测显示，miR-92a-3p与HOXA13的3'UTR存在结合位点，提示HOXA13可能是miR-92a-3p的潜在靶基因。双荧光素酶实验证实miR-92a-3p与HOXA13之间存在靶向调控关系；Western blot结果进一步证实miR-92a-3p过表达可降低HOXA13蛋白水平，而miR-92a-3p敲低表现出相反作用，表明miR-92a-3p靶向负调控HOXA13表达。为了进一步验证miR-92a-3p在高糖诱导的肾小球系膜细胞损伤中的作用机制，本研究在敲低miR-92a-3p的基础上，采用小分子干扰技术下调HOXA13表达，结果显示抑制HOXA13表达可明显减弱miR-92a-3p敲低对高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡的抑制作用；提示敲低miR-92a-3p可能通过靶向上调HOXA13表达来抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡。

综上所述，高糖诱导的肾小球系膜细胞中miR-92a-3p表达上调，HOXA13表达下调，敲低miR-92a-3p可通过靶向上调HOXA13表达抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡进而减轻细胞损伤。但由于miRNA可以靶向多个mRNA，其是否可通过调控其他靶基因参与高糖诱导的肾小球系膜细胞损伤仍需进一步探究。在未来的研究中将结合体内动物实验对miR-92a-3p的作用机制进行深入分析。