大黄素对脂多糖刺激下肺泡Ⅱ型上皮细胞表达促凝及纤溶抑制因子的调节作用

郑兴昊 李清 沈锋 杨贵霞 李想 肖川

1贵州医科大学附属医院重症医学科（贵阳 550004）；2贵州中医药大学第二附属医院麻醉科（贵阳 550002）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）基本病理改变为肺泡毛细血管损伤、肺水肿及后期的肺组织纤维化等[1]。顽固性低氧血症是引起ARDS相关性多器官功能障碍（MODS）及死亡的重要原因。研究[2-3]表明，在ARDS疾病中存在肺泡促凝亢进和纤溶抑制，引起肺血管内广泛微血栓、肺泡大量纤维蛋白沉积，导致肺泡死腔增多、通气血流比例（V/Q）失调等，引起ARDS顽固性低氧血症[4-5]。因此，针对上述改变，研究有效药物，有望改善ARDS治疗结局。大黄素（Emodin，ED）是天然的蒽醌衍生物[6]，被广泛应用于治疗流感、败血症等疾病[7-10]。既往研究[11-13]表明，ED能通过抑制NF-κB信号通路减轻肺损伤。笔者前期研究发现，ED能有效改善LPS引起的ARDS肺泡过度促凝和纤溶抑制状态，抑制肺组织过度炎症反应，具有较好肺保护作用[14]，但它的作用机制不清楚。而肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）对肺泡纤溶抑制及促凝有非常重要的调控效用[15]。本文以AECⅡ为主要研究对象，观察ED对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下该细胞中促凝和纤溶抑制相关因子的影响，探索该药作用环节。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂选用大鼠AECⅡ细胞株（中南大学细胞库），LPS、ED（Sigma公司）；组织因子（TF）一抗（美国 NOVUS公司），3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）一抗（中国武汉），组织因子途径抑制剂（TFPI）、纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）一抗和二抗（美国 Abcam），TFPI、PAI-1、TF引物序列（中国上海）；凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、Ⅲ型前胶原肽（PⅢP）及APC的ELISA试剂盒（上海）。

1.2 实验分组及处理将传代培养的AECⅡ细胞分为5组。正常对照（NC）组：不做任何处理常规培养；LPS组：参考前期研究方法[15]对细胞进行LPS处理；不同剂量ED组：加入ED 0.25、0.5及1 μg/mL处理细胞1 h，然后加入LPS继续培养24 h。

1.3 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（CCK-8）筛选ED的最佳浓度取AECⅡ细胞悬液加入96孔板，细胞贴壁后加入不同浓度的ED溶液并培养24 h。换液后加入10%CCK-8溶液10 μL，培养箱中孵育4 h，酶标仪检测450 nm处吸光度（A），计算细胞存活率。选取与空白组相近细胞活力的ED浓度作为研究浓度。

1.4 Western blotting检测 TF、TFPI、PAI-1的蛋白表达收集处理完毕的细胞，裂解细胞，高速低温离心，收集上清液，按Western blotting检测试剂盒操作说明检测TF、TFPI、PAI-1蛋白表达。实验重复3次，取均值。

1.5 RT-qPCR检测AECⅡ细胞中TF、TFPI、PAI-1的mRNA表达收集处理完毕的细胞，加入Trizol裂解液裂解，离心；根据RT-qPCR方法进行操作。选用2-ΔΔCt法计算所需基因的表达量。

1.6 ELISA检测上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP的水平取一定量的AECⅡ细胞上清液，根据试剂盒说明书进行检测，测定A值时选用波长450 nm的酶标仪，选取标准曲线计算得到AECⅡ细胞上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP水平。

1.7 统计学方法采用Graphpad Prism9.0软件作图并统计学分析；符合正态分布的数据，计量资料使用均数±标准差，组别间的比较选用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐性时组别间的均数间两两比较使用 SNK-q（Student-Newman-Keuls）检验法，当方差不齐时使用Tamhane's T2检验法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8法筛选ED的最佳浓度如图1所示，分别予0.25、0.5、1、2、4 μg/mL 5个 ED浓度培养细胞后进行CCK-8检测，结果显示当ED浓度达到1 μg/mL后细胞增殖呈逐渐下降趋势，故选1 μg/mL的剂量浓度作为后续实验研究的最高剂量。

图1 CCK8实验中各组AECⅡ细胞的活性Fig.1 Activity of AECⅡcells in each group in CCK8 experiment

2.2 ED剂量依赖性改善AECⅡ细胞中PAI-1、TFPI、TF的蛋白表达使用LPS刺激以后，细胞中TF和PAI-1的蛋白表达量显著增加，TFPI蛋白表达显著减少（均P＜0.05）。ED剂量依赖性逆转了PAI-1、TF和TFPI的蛋白改变（均P＜ 0.05）（图2，表1）。

图2 蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测各组大鼠AECⅡ细胞中PAI-1、TFPI、TF的蛋白表达Fig.2 The protein expressions of PAI-1，TFPI and TF in AECⅡcells were detected by Western blotting

表1 各组AECⅡ细胞中TF、TFPI、PAI-1的蛋白表达比较Tab.1 Comparison of TF，TFPI and PAI-1 protein expression in AECⅡ cells of each group ±s

表1 各组AECⅡ细胞中TF、TFPI、PAI-1的蛋白表达比较Tab.1 Comparison of TF，TFPI and PAI-1 protein expression in AECⅡ cells of each group ±s

注：NC组是正常对照组，LPS组是脂多糖损伤刺激组，L-ED组、M-ED组、H-ED组分别是ED 0.25、0.5、1 μg/mL组；与NC组比较，a P ＜0.05；与LPS组比较，b P ＜0.05；与 L-ED组比较，c P ＜0.05；与M-ED组比较，d P＜0.05，F为两个均方的比值（效应项/误差项）

样本数（个）3 3 3 3 3组别NC组LPS组L-ED M-ED H-ED F值P值TF/GAPDH 0.25±0.02 0.80±0.02a 0.57±0.01ab 0.46±0.01abc 0.38±0.01abcd 728.3＜0.000 1 TFPI/GAPDH 0.59±0.01 0.31±0.03a 0.40±0.01ab 0.45±0.02ab 0.51±0.04ab 52.52＜0.000 1 PAI-1/GAPDH 0.31±0.03 0.85±0.04a 0.63±0.08ab 0.52±0.04ab 0.45±0.01ab 56.28＜0.000 1

2.3 ED剂量依赖性改善AECⅡ细胞PAI-1、TF、TFPI的mRNA表达使用LPS刺激AECⅡ细胞后其TF和PAI-1的mRNA表达量显著增加，TFPI mRNA表达量显著减少（均P＜0.05）。使用不同剂量ED培养的细胞TF和PAI-1的mRNA表达量都较LPS组剂量依赖性减少，TFPI剂量依赖性增加（P＜0.05），如表2所示。

表2 各组AECⅡ细胞TF、TFPI、PAI-1 mRNA表达比较Tab.2 Comparison of TF，TFPI，PAI-1 mRNA expression in AECⅡcells of each group ±s

表2 各组AECⅡ细胞TF、TFPI、PAI-1 mRNA表达比较Tab.2 Comparison of TF，TFPI，PAI-1 mRNA expression in AECⅡcells of each group ±s

注：NC组是正常对照组，LPS组是脂多糖损伤刺激组，L-ED组、M-ED组、H-ED组分别是ED 0.25、0.5、1 μg/mL组；与NC组比较，a P ＜0.05；与LPS组比较，b P ＜0.05；与 L-ED组比较，c P ＜0.05；与M-ED组比较，d P＜0.05，F为两个均方的比值（效应项/误差项）

组别NC组LPS组L-ED M-ED H-ED F值P值样本数（个）3 3 3 3 3 TF 0.45±0.01 2.47±0.02a 2.00±0.01ab 1.36±0.07abc 1.02±0.06abcd 1072＜0.000 1 TFPI 1.00±0.06 0.26±0.01a 0.51±0.02ab 0.62±0.01abc 0.70±0.02abcd 261.0＜0.000 1 PAI-1 1.00±0.04 2.63±0.01a 2.39±0.03ab 2.06±0.04abc 1.84±0.10abcd 367.9＜0.000 1

2.4 ED剂量依赖性改善AECⅡ细胞上清液中TAT、AT-Ⅲ、APC及PⅢP水平LPS刺激后，AECⅡ细胞上清液中AT-Ⅲ、APC水平显著少于NC组，PⅢP、TAT水平显著多于NC组（均P＜0.05）。ED剂量依赖性逆转了上述因子的水平（均P＜0.05），如表3所示。

表3 各组AECⅡ细胞上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP水平比较Tab.3 Comparison of APC，AT-Ⅲ，TAT，PⅢ P levels in the supernatant of AECⅡcells in each group ±s

表3 各组AECⅡ细胞上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP水平比较Tab.3 Comparison of APC，AT-Ⅲ，TAT，PⅢ P levels in the supernatant of AECⅡcells in each group ±s

注：NC组是正常对照组，LPS组是脂多糖损伤刺激组，L-ED、M-ED、H-ED组分别是ED 0.25、0.5、1 μg/mL组；与NC组比较，a P ＜0.05；与LPS组比较，b P ＜0.05；与 L-ED组比较，c P ＜0.05，F为两个均方的比值（效应项/误差项）

组别NC组LPS组L-ED M-ED H-ED F值P值组别NC组LPS组L-ED M-ED H-ED F值P值样本数（个）3 3 3 3 3样本数（个）3 3 3 3 3 APC（ng/mL）1 421.80±40.49 998.19±8.95a 1 095.85±4.53ab 1 234.42±26.37abc 1 296.48±47.2abc 88.96＜0.000 1 TAT（ng/mL）9.93±0.40 17.69±0.23a 13.85±0.72ab 13.36±0.89abc 11.80±0.37ab 72.09＜0.000 1 AT-Ⅲ（ng/mL）131.41±2.16 77.72±2.77a 90.85±3.24ab 114.42±3.70abc 118.94±3.21abc 153.2＜0.000 1 PⅢP（ng/mL）185.50±1.27 280.81±10.99a 241.48±9.35ab 221.44±5.52abc 214.31±4.29ab 74.50＜0.000 1

2.5 ED对细胞核内p65表达的影响为了观察大黄素预处理对LPS刺激下细胞核内p65表达，我们使用免疫荧光法测定细胞核中p65水平。结果如图3所示，ED预处理明显降低了细胞核内p65蛋白荧光染色。

图3 AECⅡ细胞核中p65的检测Fig.3 Detection of p65 in the nucleus of AECⅡ

3 讨论

本实验采用既往LPS浓度（5 μg/mL）刺激肺泡上皮细胞[16]，模拟革兰阴性杆菌诱导ARDS细胞模型。通过LPS刺激AECⅡ细胞后，使得其PAI-1、TF的表达水平均明显升高，TFPI表达水平则明显降低；细胞上清液中ATⅢ、APC含量均明显减少，PⅢP、TAT含量则明显增加，与我们前期结果一致[15-16]。ED预处理AECⅡ细胞，可明显抑制LPS刺激引发的TF、PAI-1表达增加，促成TFPI表达；另一方面又可明显减少细胞上清液中PⅢP、TAT水平，增加APC、AT-Ⅲ含量。提示ED能有效逆转LPS刺激引起的促凝和纤溶抑制因子的变化。

TF是较强的促凝因子，其异常表达在血栓形成、动脉粥样硬化和急性冠脉综合征等凝血疾病中起重要作用[17-18]。TFPI是TF的生理抑制剂，通过抑制TF-FVIIa复合物形成来抑制TF诱导的凝血[19-20]。PAI-1是主要的纤溶抑制剂，抑止纤维蛋白溶解从而增加纤维蛋白沉积[21]。ATⅢ由SerpinC1基因编码[22]，与内皮细胞表面的肝素样物质相互作用起抗凝作用。蛋白C的活性形式为APC，具有强大的抗凝血活性[23]。TAT 代表凝血酶生成量，可用于评估机体的凝血激活状态[24]。机体组织纤维化的程度则是通过PⅢP反映的，它的变化决定了体内纤维组织的含量[25]。本研究提示，ED预处理明显抑制了LPS刺激下AECⅡ细胞表达及分泌纤溶抑制因子和促凝，而增加抗凝因子的水平，提示ED具有纠正LPS刺激下AECⅡ细胞促凝和纤溶抑制因子表达的失衡，与我们前期结果相符合[14]。本文结果还表明AECⅡ细胞是ED作用靶点之一。免疫荧光提示LPS刺激导致细胞核中p65蛋白荧光染色增强，表明LPS刺激促进了p65的核移位。ED却显著降低了细胞核内p65蛋白水平，提示该药的作用与抑制NF-κB信号通路有关。

本研究事先通过CCK-8确定了ED的安全剂量范围。因此，可排除药物本身对细胞的毒性作用。在所选取的剂量范围内，随着剂量增大，ED的作用逐渐增加，提示该药的作用效果可能存在一定剂量依赖关系。本实验的不足：（1）基础实验和临床应用存在一定的差异，本研究通过LPS刺激[13]AECⅡ细胞对纤溶和凝血反应得到的结果不一定完全与临床相符，因此还需更深入的临床研究证实；（2）对于ED剂量的选择可进一步优化；（3）对于ED的作用机制未能明确说明。

综上所述，ED在一定程度上抑制了LPS刺激下Ⅱ型肺泡上皮细胞表达及分泌纤溶抑制因子和促凝的能力，该作用可能与其抑制NF-κB信号通路活化有关。