新型冠状病毒核酸快速检测单靶标阳性结果分析

李育敏，龚海娜，付晓歌，曾子郎，郭东月，姚洁仪，李双，张秀明

(深圳市罗湖医院集团医学检验实验室&深圳大学第三附属医院检验科，广东深圳 518001)

2021年8月，《新型冠状病毒核酸快速检测临床规范化应用专家共识》发布[1]，提出新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)核酸快速检测是常规检测的补充，在因特定原因需尽快获得检测结果、待检人群数量较少、实验室空间场地限制的情况下，可考虑采用快速检测。为贯彻落实国家对发热门诊、机场、海关、口岸、火车站等场景需要快速出具核酸检测报告的疫情防控策略，新型冠状病毒核酸快检迅速在上述各机构开展起来。核酸快检技术虽然明显缩短了检测时间，使阳性感染者能够得到快速有效的管控，降低其继续传播病毒的风险，但是同样也面临着检测灵敏度和特异性的问题，尤其是单靶标阳性结果，需要再次进行复核[1]，增加了检出的时间。因此，实验室为确保核酸快检结果及时、准确，需做好质量控制(质控)和结果判读。本研究对收集到的核酸快检单靶标阳性结果进行分析探讨，以期为临床实验室检测和结果判读、复核及解释提供参考。

1 材料与方法

1.1样本 收集2021年1月1日至2022年8月16日在深圳市罗湖医院集团医学检验实验室采用快检试剂检测的咽拭子标本，所有样本均为单独采样。严格按照医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)和新型冠状病毒肺炎防控方案(第九版)要求[2-3]进行样本采集、送检和保存。

1.2试剂与仪器 核酸提取试剂盒(磁珠法，重庆中元汇吉公司)，新型冠状病毒2019-nCoV核酸快检试剂盒(荧光PCR法，达安基因公司)，新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法，上海伯杰公司)。EXM6000全自动核酸提取仪(重庆中元汇吉公司)，AGS8830-8型和AGS8830-16型实时荧光定量PCR仪(杭州安誉公司，用于核酸快检)，SLAN-96S荧光定量PCR仪(上海宏石公司，用于核酸常规检测)。

1.3标本处理和检测 将病毒采样管置于振荡器上，振荡10 min，分别采用快检(达安试剂)和常规检测(伯杰试剂)2种方法进行平行检测。按照核酸提取试剂盒说明书进行核酸提取，按照核酸扩增检测试剂盒说明书进行核酸扩增。

1.4结果判读

1.4.1室内质控 3份阴性质控检测结果均为阴性，1份弱阳性质控结果为阳性，且Ct值符合预期值，视为室内质控在控，否则为失控。质控在控时检测数据可接受。

1.4.2达安快检试剂结果判断 (1)如果检测样本在FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值>30，且Cy5通道有扩增曲线、Ct值≤30，可判断样本为2019-nCoV阴性。(2)如果检测样本在FAM和VIC通道Ct值≤30，且有明显的扩增曲线，Cy5通道有或无扩增曲线，可判样品为2019-nCoV快检结果阳性。(3)如果出现以下2种情况，结果须复检(同试剂)：a.检测样本仅在 FAM或VIC单一通道Ct值≤30，另一通道Ct值>30或无扩增曲线，Cy5通道有或无扩增曲线；b.检测样本在FAM通道Ct值>30或无扩增曲线，VIC通道Ct值>30或无扩增曲线，Cy5通道Ct值>30或无扩增曲线。复检结果判定：内标Ct值>30或无扩增曲线样本需重新取样检测。

1.4.3伯杰试剂结果判断 (1)如果检测样本在FAM和VIC通道Ct值>40，ROX通道Ct值≤40，可判断样本为2019-nCoV阴性。(2)如果检测样本在FAM、VIC、ROX通道Ct值≤40，且曲线有明显的扩增曲线，可判样品为2019-nCoV阳性。(3)如果检测样本在FAM或者VIC通道Ct值≤40，另一通道无Ct值或大于40，须复检(同试剂)，复检结果与原结果一致，可判读为2019-nCoV阳性，否则为阴性。如快检和常规检测均为单靶标阳性，送深圳市疾控中心(CDC)和深圳市罗湖区CDC复核。

1.4.4CDC复核 CDC对初筛阳性样本采用2种常规检测试剂(达安基因公司和上海伯杰公司)进行复核。

2 结果

2.1检测概况 经CDC复核，实验室通过核酸快速检测，共检出阳性257例，其中单靶标阳性38例(表1)，CDC复核结果为阳性或建议重新采样，包括12例复阳；其中单靶标N基因阳性有20例，单靶标ORF1ab基因阳性18例，建议重新采样的6例标本中，5例为复阳标本。

2.2单靶标N基因阳性 20例单靶标N基因阳性结果的Ct值为26.48～31.06，其中10例为复阳；经常规试剂平行检测，其中13例结果为双靶标(ORF1ab和N基因)阳性，包括5例复阳；7例仍为单靶标N基因阳性，包括5例复阳，见表1。

2.3单靶标ORF1ab基因阳性 18例单靶标ORF1ab基因阳性结果的Ct值为27.17～30.01，其中2例为复阳；经常规试剂平行检测，其中11例结果为双靶标(ORF1ab和N基因)阳性，5例结果为单靶标N基因阳性(包括2例复阳)，2例仍为单靶标ORF1ab基因阳性，见表1。

表1 38例新冠病毒核酸快速检测单靶标阳性结果

3 讨论

按照《新型冠状病毒核酸快速检测临床规范化应用专家共识》[1]，新冠病毒快检结果为阳性，应使用另外1～2种更为灵敏且扩增不同靶区域的常规核酸检测试剂对原始样本进行复检，复核阳性方可报告结果。本实验室在前期对核酸快检系统进行性能验证的研究中发现，在厂家声明的检出限500 copies/mL浓度水平重复测定20次，双靶标(ORF1ab和N基因)的检出率仅为65%，这是由于其中单靶标N基因的检出率为20/20，而单靶标ORF1ab基因为13/20；快检和常规检测2种方法阳性符合率为82.4%[4]，这表明针对弱阳性标本，快检系统检出率低于常规检测。本研究中38例快检单靶标阳性标本经常规试剂平行检测有24例为双靶标阳性，这也提示常规试剂的灵敏度较快检系统更高。因此，建议对有中高风险地区的城市来源的人群，如口岸入境人员等，可同时进行快检和常规PCR 2种方法扩增，一方面确保检测结果及时，对阳性人员采取“早发现、早报告、早隔离”的措施；另一方面可避免弱阳性标本的漏检，确保检测结果准确可靠。

目前国内大部分核酸检测方法主要针对N基因和ORF1ab基因设计特异性引物和荧光探针。在新冠病毒基因组中，N基因相对保守，而ORF1ab基因特异性强，是病毒鉴定的重要标志物[5]。本研究检出的38例经CDC复核后的快检单靶标阳性标本中，单靶标N基因阳性20例，经常规试剂平行检测，13例为双阳，7例仍为N基因单阳；单靶标ORF1ab基因阳性有18例，常规试剂平行检出11例为双阳，5例为N基因单阳(包括2例复阳)，2例仍为ORF1ab单阳。20例快检N基因单阳中有10例为复阳；18例快检ORF1ab基因单阳中，仅2例为复阳，这提示临床应高度重视快检单靶标ORF1ab基因初筛阳性的结果。在核酸检测过程中，由于受ORF1ab基因的拷贝数和特异性，以及试剂对ORF1ab基因和N基因的检测灵敏度差异影响，通常观察到的现象是单靶标N基因的阳性率高于单靶标ORF1ab基因[6-9]，而且还需注意单靶标N基因阳性是否为非特异的假阳性，当出现多个单靶标阳性的时候应考虑是否发生污染。本研究提示发现快检单靶标ORF1ab基因阳性时，排除非特异因素，应高度警惕其检测结果为真阳性的可能，需及时进行常规试剂复核，以便尽早报告结果。

本研究有12例快检单靶标阳性为复阳，其中有快检结果为一种单靶标阳性，而常规检测为另一种单靶标阳性的情况，也有快检呈单靶标阳性而常规试剂检测为双靶标阳性，这与复阳个体体内存在的不是活病毒，病毒序列不完整，为残存的核酸片段有关。复阳检测结果可能会出现不同的试剂检出不同的单靶标阳性；或同一种试剂重复测定检出不同的单靶标阳性；或重复测定部分阳性，部分阴性；以及检出阳性后，重新采样检测为阴性，连续多日阴性后又检出阳性等情况。

综上所述，在临床检测过程中，应结合流行病学史、不同试剂的检测结果、原始扩增曲线以及Ct值进行综合判断和结果分析；对需要重新采样的样本应严格按照国家文件进行重新采样复核[3]；对复阳人群参照国家最新发布的第九版《新型冠状病毒肺炎防控方案》[3]采取相关处理措施。