二氧化碳培养箱二氧化碳浓度的在线校准方法

张佳仁，吴成新，李耀悦

（上海市质量监督检验技术研究院，上海 201114）

细胞是有机体和生命活动的基本单位，是具有独立、有序的自控代谢体系，深入研究细胞对于揭开生命奥秘和疾病治疗等具有十分重要的意义。开展细胞研究离不开细胞培养技术，这是一种可以直接观察活细胞形态结构、生命活动及其变化的实验技术，是实验室模拟细胞体内生长的常用研究方法[1]，已经广泛应用于细胞学、遗传学、肿瘤学、分子生物学、病毒学和免疫学等领域。在细胞培养过程中，需要提供适宜的温度、湿度、二氧化碳浓度和酸度等满足其生长和发育的生理条件与环境，一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37 ℃，pH 控制在7.2～7.4，二氧化碳体积分数控制在5.0%[2-3]。二氧化碳对细胞膜具有直接作用，一般认为二氧化碳和细胞膜的脂质发生了化学反应，导致细胞膜通透性能变化，降低了细胞摄取离子和营养的能力；细胞外的二氧化碳浓度直接影响影响细胞内pH，改变细胞活性[4-5]。二氧化碳浓度的不合理偏差和波动性会直接导致细胞培养减慢和细胞分化，降低细胞培养质量[6]。

二氧化碳培养箱通常由二氧化碳浓度控制系统、温度控制系统和空气循环系统等组成，可以在箱体内模拟形成细胞在生物体内的生长环境，提供稳定的温度(37 ℃)、二氧化碳浓度(体积分数5.0%)，是细胞培养的一种先进仪器和必需的关键设备[7]。培养箱的二氧化碳体积分数应控制在(0～20)%，且当二氧化碳体积分数为5.0%时，示值误差应不大于0.5%[8]。培养箱对于二氧化碳浓度的技术要求较高，因此保证二氧化碳培养箱的量值准确性与溯源性具有非常重要的意义。

JJF 1101—2019《环境试验设备温度、湿度参数校准规范》只适用于培养箱、霉菌试验箱、腐蚀气体箱等设备的温度及湿度参数校准[9]，二氧化碳培养箱温度、湿度的量值溯源可参照此规程。然而其二氧化碳浓度的量值溯源没有相应的检定规程或校准规范，导致该仪器的性能无法评价。为了更好地服务相关生产企业与使用单位，笔者根据相关标准[8-10]及仪器说明书，建立了二氧化碳培养箱中二氧化碳浓度的在线校准方法。在线校准方法以红外吸收法为理论依据，可在培养箱正常工作的情况下，将红外浓度传感器放置于箱体内部，或者通过校准口抽取箱体内部气体至红外浓度传感器的检测室，即可测量二氧化碳培养箱中二氧化碳浓度。此方法的优点在于：保证被检设备结构完整的情况下，无需停机，允许保持被检设备的运行状态，校准过程可与培养实验同时进行。

1 实验部分

1.1 实验原理

目前二氧化碳的检测方法较多，主要有红外吸收法、气相色谱法、滴定法、固体电解质法、热量法和光纤检测法等[11]。红外吸收法因其准确度高、响应快和便捷性强，被广泛应用于二氧化碳浓度的在线测量[12]，即不停机无损测量。

每种气体分子在化学结构上存在差异性，导致各气体对特定波长的红外辐射吸收程度具有唯一性。特定气体的红外吸收强度与浓度成正比关系。红外吸收法是基于二氧化碳对4.26 μm的红外线具有选择性吸收的能力，且二氧化碳对红外辐射的吸收能力与二氧化碳浓度之间符合朗伯-比耳定律，即吸收强度与浓度成正比关系。因此，通过检测二氧化碳的红外光强度的变化，便可以定量地确定二氧化碳的浓度[13]。

1.2 环境条件

环境温度：10～35 ℃；相对湿度：不大于80%；供电电压：(220±22)V；周围无强烈震动，无强电磁场干扰。

1.3 主要仪器

1.3.1 标准器

二氧化碳浓度通常采用二氧化碳测定仪来测定，该仪器的核心部件为传感器，由标准光源、测量室、滤波器和红外检测器组成[14]。红外辐射从光源通过测量的气体传到检测器，位于检测器前面的滤波器防止非测量气体特有的波长抵达检测器，检测光强度并将其转换为气体浓度值。

1.3.2 传感器

传感器分为扩散式和抽吸式，这两种类型的传感器均可用于二氧化碳浓度的在线测量[15]，主要区别在于扩散式的浓度传感器需要被放置于培养箱箱体内，传感器内部测量室与箱体二氧化碳浓度需要达到平衡；抽吸式的浓度传感器需要连接至培养箱外部的气体校准口，用自带的气泵将箱体内浓度抽吸至传感器的测量室。对于有气体校准口的培养箱，优先选择抽吸式传感器。若选择扩散式的传感器，则将传感器放置于培养箱箱体内部，位置尽量靠近被检浓度检测器附近，柜门与传感器引线的夹缝处用胶泥填满；若选择抽吸式传感器，则用专用软管连接培养箱气体校准口与传感器的进气口。

2 校准项目与校准方法

2.1 二氧化碳浓度偏差

定义：培养箱在稳定状态下的一段时间内，二氧化碳浓度的显示值与测定平均值的差值。

二氧化碳浓度偏差按式(1)计算：

式中：Δφ——二氧化碳浓度偏差，%；

φd——培养箱中二氧化碳浓度的显示值，%；

φs——二氧化碳体积分数的测定平均值，%。操作步骤：(1)检查柜门与箱体的密封性，确保校准过程无气体泄露。(2)若选择扩散式的浓度传感器，则将传感器至于箱体内部，尽量靠近箱体本身浓度检测器的位置；若先择抽吸式浓度传感器，则用专用软管连接箱体校准口与传感器进气口。(3)设定培养箱的二氧化碳浓度值，开启运行。(4)待箱体内二氧化碳浓度稳定后开始记录浓度实测值，记录时间间隔为2 min，30 min 内共记录15 组数据。二氧化碳浓度稳定时间以说明书为依据，说明书中没有给出的，一般按以下原则执行：培养箱的显示仪表达到设定值后，等待至少30 min且仪表显示值波动范围不大于0.03%，最长的的稳定时间不超过60 min[16]。(5)计算培养箱显示值与15组实测值的平均值之差。

2.2 二氧化碳浓度波动性

定义：培养箱在稳定状态下的一段时间内，培养箱箱体内二氧化碳浓度的测定值随时间的变化量，具体为测定值中的最大值与最小值之差的一半，冠以±号，按式(2)计算：

式中：Δφt——温度波动性，%；

φs，max——二氧化碳浓度测定值中的最大值，%；

φs，min——二氧化碳浓度测定值中的最小值，%。

操作步骤：二氧化碳浓度波动性可与二氧化碳浓度测定值偏差一同进行校准，计算15组浓度测定值中极差值的一半。

3 校准实例

样品：Herocell 240 型二氧化碳培养箱，显示分辨力为0.1%，稳定时长为15 min。

主要标准器：MI70 型二氧化碳测定仪(扩散式)，配GMP251 传感器，测量值最大允差(MPE)为±0.20%，分辨力为0.001%，维萨拉(北京)测量技术有限公司。

环境条件：温度为21～22 ℃，相对湿度为62%～67%，周围无强烈震动，无强电磁场干扰，箱体密封性完好。

培养箱二氧化碳浓度设定为5.00%，扩散式传感器置于培养箱内，靠近内部检测器。待箱内二氧化碳浓度稳定后，记录二氧化碳浓度测定值，记录时间间隔为2 min，30 min 内共记录15 组数据。测量结果见表1。由表1 数据计算可知，二氧化碳浓度偏差为0.158%，二氧化碳浓度波动性为±0.071%。

表1 二氧化碳体积分数测定结果 %

4 不确定度评定示例

4.1 输入量的标准不确定度

4.1.1 二氧化碳浓度的测量重复性引入的不确定度u(φ)

二氧化碳浓度的测量重复性引入的不确定度u(φ)按照A类评定，重复测量标准偏差按式(3)计算：

将表1 二氧化碳浓度的测量数据代入式(3)，计算得标准偏差s(φ)=0.083%，则由15 次独立重复测量引入的标准不确定度分量：

4.1.2 二氧化碳测定仪的准确度引入的不确定度u(φs)

4.2 合成标准不确定度

浓度偏差数学模型：Δφ=φd-φs，灵敏系数：C1=1，C2=-1。则合成不确定度：

5 结语

针对二氧化碳培养箱建立了二氧化碳浓度偏差和波动性的校准方法。此校准方法合理性、可操作性强。校准用的标准器可溯源至公用计量标准，可以保证测量数据的准确可靠。此校准方法可为出厂检验、第三方验证、计量机构校准提供参考借鉴。