同种属来源抗体免疫组化双重染色的应用体会

韩 雪，宋国新，王 敏，陈 刚，季 盼，张炜明

免疫组化双重染色是指在同一张切片上同时显示两种不同的抗原，大多采用异种属抗体间接标记法，即两种标记的一抗分别来源于不同种属。临床实践中使用的一抗种属单克隆鼠来源较多，满足免疫组化双染可配伍组合抗体少，限制了免疫组化双染技术的应用。本科室通过实验摸索，对免疫组化双染方法进行改良，使得相同种属来源的抗体也可进行免疫组化双染。本文以肺腺癌组织Ki-67+CK7免疫组化双染为例，介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集南京医科大学第一附属医院病理学部经10%中性福尔马林固定的肺腺癌组织60例，每例组织连续切片3张，切片厚度3 μm，防脱载玻片捞片，分别用于CK7、Ki-67免疫组化单染和Ki-67+CK7免疫组化双染。

1.2 试剂Ki-67(鼠单抗，MX006)、CK7(鼠单抗，OV-TL12/30)、HRP标记羊抗小鼠IgG聚合物与DAB显色试剂盒购自福州迈新公司；内源性过氧化物酶阻断剂、SAP试剂盒(生物素标记山羊抗小鼠IgG工作液、碱性磷酸酶标记链霉卵白素工作液)、快红显色剂购自北京中杉金桥公司；2 mol/L H2SO4溶液为实验室自配。

1.3 方法第1组切片行CK7免疫组化单染，DAB显色；第2组切片行Ki-67免疫组化单染，DAB显色；第3组切片行Ki-67+CK7免疫组化双染。免疫组化双染步骤如下：(1)常规组织切片脱蜡水化；(2)柠檬酸抗原修复液(pH 6.0)高温高压热修复12 min，自然冷却；PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(3)滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(4)滴加一抗Ki-67(鼠单抗)，4 ℃孵育过夜或37 ℃孵育1 h，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(5)滴加HRP标记羊抗小鼠IgG聚合物，室温孵育20 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(6)滴加DAB显色液，镜下控制显色3 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(7)滴加2 mol/L H2SO4溶液，室温2 min，流水冲洗5 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(8)滴加一抗CK7(鼠单抗)，4 ℃孵育过夜或37 ℃孵育1 h，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(9)滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG工作液，37 ℃孵育15 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(10)滴加碱性磷酸酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(11)滴加快红显色液，室温孵育10～15 min，镜下控制显色，自来水充分洗涤；(12)苏木精复染，水溶性封片胶封固，镜下观察。

1.4 结果判读由两名高年资病理医师对所有染色切片进行双盲判读：CK7表达于正常腺上皮及肺腺癌上皮细胞，阳性定位于细胞质；Ki-67主要表达于增殖期细胞，阳性定位于细胞核。免疫组化单染时CK7、Ki-67呈棕色，免疫组化双染时CK7呈玫红色、Ki-67呈棕色。

2 结果

第1组切片中CK7阳性细胞胞质呈棕色，染色背景干净，细胞定位清晰(图1)；第2组切片中Ki-67在肿瘤细胞及周围炎症细胞均有表达，阳性细胞胞核呈棕色，细胞定位清晰(图2)；第3组切片中CK7阳性细胞胞质呈鲜艳玫红色，Ki-67阳性细胞胞核呈棕色，Ki-67+CK7阳性共染肿瘤细胞镜下清晰可见，同时可见肿瘤细胞周围围绕较多核阳性的非肿瘤细胞(图3、4)。与免疫组化单染相比，免疫组化双染组CK7、Ki-67表达定位及染色强度无差别，通过计数共染肿瘤细胞占比，使得肿瘤细胞增殖指数的判读结果更准确可靠。

①②③④

3 讨论

应用组织切片进行免疫组化双染，可以克服同一病例切片间因不同时间或空间差异而引起的样本误差，提高诊断信息量，与免疫组化单染相比，免疫组化双染在观察组织中两种标记抗体的相互定位关系时具有无可比拟的优越性。

Ki-67是评估肿瘤细胞增殖活性指标，因肿瘤组织内细胞种类复杂，Ki-67实际计数时易受各类非肿瘤的阳性背景细胞干扰，导致不同观察者间或同一观察者不同观察时间点的计数结果有一定差异，影响肿瘤预后的精准分析。本文应用的Ki-67+CK7免疫组化双染，可在同一张组织切片上清晰标记出Ki-67染色阳性的肿瘤细胞，方便观察者对增殖的肿瘤细胞精准计数，可提高Ki-67判读结果的一致性。

常规免疫组化双染关键环节在于：(1)合理的染色抗体配伍组合，确保所选标记抗体定位于不同细胞或同一细胞的不同部位，并用不同颜色的显色试剂区分[1-2]，常规应用的辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)分别与底物作用后可获得较好的棕色与玫红色着色对比；(2)避免两种标记抗体之间的交叉反应，一般市售双染试剂盒中的两种抗体分别来自不同种属，即一个兔来源和一个鼠来源的抗体，但实际工作中常用的一抗大都来自同一种属，即鼠来源，可供配伍双染的抗体组合少，限制了免疫组化双染技术的应用。

本文中Ki-67和CK7都是鼠来源抗体，本实验对常规免疫组化双染方法作如下改良，使之可适用于两种同一种属来源抗体的免疫组化双染：(1)应用2 mol/L H2SO4灭活第1次染色后残留酶及一抗的活性，充分洗涤后，可避免与第2个一抗间相互干扰，同时低浓度酸短时处理切片后并不会影响后续免疫组化染色，也不会影响第1次染色过程中的DAB着色[3]；(2)两步法与三步法相结合，两步法标记第一个抗体显色，再用三步法标记第二个抗体，即第二个一抗孵育后，先与生物素标记山羊抗小鼠IgG结合，再用碱性磷酸酶标记链霉卵白素示踪后快红显色，较之碱性磷酸酶直接标记的羊抗小鼠IgG聚合物二抗，大大提高了检测的敏感性。

随着克隆抗体制备与标记技术的发展，免疫组化双染技术日趋成熟。为保证免疫组化双染效果，需加强从标本送检到组织处理各个环节的质量控制。首先，组织的处理质量可直接影响染色效果，拟行免疫组化双染前应由诊断医师结合组织形态学，充分评估组织处理情况后合理选择配伍抗体[4-7]。其次，所选择的配伍抗体应是特异性、敏感性高的抗体，即所选择的抗体在单染时有较好的标记效果。最后，免疫组化双染步骤较多，操作者需要更加耐心和细心，严格按操作流程进行，才能获得优良的免疫组化双染切片。