纸基微流控芯片的构建及在亚硝酸盐检测中的应用

陈港 张梦丽 魏渊 蒋晨颖 李方

(华南理工大学 制浆造纸工程国家重点实验室，广东 广州 510640)

微流控芯片又称为芯片实验室，是指在一块仅几平方厘米的芯片上实现生物、化学实验室分析过程的样品制备、反应、分离、检测等操作功能[1]。因其具有微型化、集成化以及便携化等特性，所以在食品安全、疾病筛查和环境保护等方面展现出许多显著优势[1- 2]。与传统的硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等基体材料相比，纸张本身优异的吸水性及内部多孔结构，使其成为微流控芯片制造领域极具吸引力和应用前景的基体材料[3- 4]。纸基微流控通道的构建一般是利用化学物质在亲水性纸张表面进行疏水改性，从而划分出亲疏水区域[5]。常见的构建方法包括光刻法[6]、刻蚀法[7- 8]、蜡印法[9- 10]、绘图法[11]、等离子体处理法[12- 13]、柔性版印刷法[14]、丝网印刷法[15]、喷墨打印法[16]等。其中，喷墨打印法因具有高分辨率、低成本及高效批量生产等优点，而成为纸基芯片制造中最前沿的技术之一[3]。

针对上述问题，本研究首先从造纸工艺出发，优化了纸基微流道的制备工艺过程，开发出一种先利用AKD表面施胶工艺对纸张表面进行疏水化改性，再采用喷墨打印技术在纸基上选择性构建亲水性微流控通道的简单方法；然后，进一步考察了表面施胶剂配比(m表面施胶淀粉/mAKD)、压光处理等因素对流体在通道内流动效果的影响，并优化了工艺条件；最后，通过表面施胶及喷墨打印技术构建纸基微流控芯片，并成功将其应用于亚硝酸盐的检测。

1 原料与方法

1.1 实验原料与设备

AKD蜡乳液、聚酰胺环氧氯丙烷树脂(PAE)，理文造纸有限公司提供；漂白桉木硫酸盐浆(水分含量10.55% ，纤维长度748 μm ，纤维宽度15.8 μm)、木薯表面施胶淀粉，珠海红塔仁恒纸业有限公司提供；二异辛基琥珀酸酯磺酸钠盐购于广东某树脂有限公司；甲基橙(纯度>95%)购于上海易恩化学技术有限公司；无水乙醇(分析纯)购于天津市富宇精细化工有限公司;α-萘胺、对氨基苯磺酸、冰醋酸、亚硝酸盐标准溶液(质量浓度为165 μg/mL)均购于上海麦克林生化科技有限公司；去离子水，电导率<5 μS/cm，采用实验室BioSafer T系列超纯水仪自制。

1.2 实验方法

1.2.1 纸基微流控芯片的设计制造

纸基微流控芯片的设计、制造过程大致包括纤维素原纸的制备、纤维素原纸表面疏水化改性、疏水纤维纸表面亲水性微流控通道构建等几个步骤，具体的工艺流程图如图1所示。

(1) 纤维素原纸的制备

将漂白桉木硫酸盐浆板疏解后，称取适量(以绝干量计)浆料，根据ISO 5269-1:2005[21]标准在自动纸页成型器(RK3AKWT，奥地利PTI公司)上抄造预设定量为80 g/m2的纤维素原纸，如图1(a)；同时，在抄造过程中添加0.5%(质量分数)的PAE湿强剂，以防止原纸在表面施胶过程中出现褶皱、破损等情况；然后，将原纸在温度(23±1)℃和相对湿度(50±2)%的环境下平衡水分24 h，备用。

图1 纸基微流控芯片设计、制造工艺流程图Fig.1 Flow chart of preparation of paper-based microfluidic chip

(2) 纤维素原纸表面疏水化改性

配制不同的表面施胶剂(m表面施胶淀粉/mAKD=8∶2，7∶3，6∶4;总固含量约为10.4%)，在实验室涂布机(ZAA2300，瑞士Zehntner公司)上对纤维素原纸进行表面涂布处理，涂布速度为2 m/min(图1(b))，随后将样品放入105 ℃的热风干燥箱(DHG 9030A，上海一恒科学仪器有限公司)中干燥5 min。最后，将纸张在辊速为3.5 m/min、压强为2 MPa条件下进行压光处理[22](图1(c))，制备得到疏水改性纤维素原纸，备用。

(3)疏水纤维纸表面亲水性微流控通道构建

首先，将自制墨水(二异辛基琥珀酸酯磺酸钠乙醇溶液与品红色染料型墨水混合液)装入爱普生打印机(R330，精工爱普生株式会社)的墨盒中，然后在上述疏水纤维纸表面打印设计好的花形图案(半径长35 mm，通道宽2 mm)或点阵图案(直径4.5 mm的圆形)，从而构建出亲水性微流控通道，如图1(d)所示。

1.2.2 液体在纸基微流控通道内的扩散性测试

为方便观察，增强液体与纸样表面微流道内颜色的对比度，实验中将配制的甲基橙溶液作为待测液滴入纸基微流道中并记录通道内的液体扩散行为。待通道内液体吸收干燥后，使用佳能扫描仪(LIDE210，佳能中国有限公司)扫描读取图案区域。

1.2.3 表面水接触角测定

实验中将表面施胶后的纸张裁剪为2.0 cm×1.5 cm大小的长方形纸样，并粘贴于载玻片表面，设置表面接触角测量仪(OCA40 Micro，德国Dataphysics公司)的滴液量和进液速度分别为4 μL和4 μL/s，测试3个不同的区域并计算平均值。

1.2.4 亚硝酸盐的检测

先将2.5 μL Griess试剂分别滴加到纸基微流控芯片各检测区域，干燥后，再将等量的质量浓度为1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L的亚硝酸盐溶液添加至检测区，反应5 min后，立即用爱色丽分光光度计(手持式色差仪，X-Rite 530，美国X-Rite公司)进行色差值测定。

1.2.5 色差值测量

首先，设置标准照明光源为D65模式，视场为10°。将手持式色差仪进行白板校正后，测量样品纸空白部分的L*a*b*值，并将其设置为相对颜色测量模式中的标准数值，再切换至样品测量模式测量目标颜色，读取颜色色差值，即为相对背景色与目标颜色的色差值。

1.2.6 色差的评价

据国际照明学会(CIE)推荐的色差与颜色差别感觉的对应关系，对样品的色差进行评价[23]。色差在数值上代表色样之间在空间坐标系中的距离，它可以带给人不同的色彩感觉。然而，人的视觉感知能力具有一定的局限性，在小色差范围内感知能力会下降，无法区分出颜色差异，所以在色差的评价中，将色差值在0～0.5、0.5～1.5、1.5～3、3～6以及大于6的范围分别定义为微小色差、小色差、较小色差、较大色差和大色差，同时在视觉感受上也分别对应为极微、轻微、明显、很明显和强烈。

2 结果与讨论

2.1 纸基微流控通道的构建

本研究中，采用自制的纤维素纸作为纸基微流控芯片的基体，通过集成表面施胶和喷墨打印技术，开发了一种简单、高效的纸基微流控芯片制造方法。其中，表面施胶和喷墨打印技术在纤维素原纸表面的作用机理，如图2所示。

图2 表面施胶和喷墨打印技术在纤维素原纸表面的作用机理Fig.2 Mechanism of surface sizing and inkjet printing on the surface of cellulose base paper

表面施胶过程中，涂覆在纤维素原纸表面的AKD颗粒，在加热条件下发生融化并在纸张纤维表面扩展，AKD分子中的内酯环受热开环与纤维上的羟基发生化学反应生成β-酮酯(图2(a))，实现在纸张表面的接枝改性，同时AKD分子的憎水端暴露在外侧，从而赋予纸张一定的疏水性[24]。但值得注意的是，AKD单独作为表面施胶剂使用时，其在纸张表面的成膜性有限，容易造成纸张表面涂覆不均匀的情况。鉴于此，为更好地在纸张表面构建均匀的疏水结构，充分发挥AKD的作用，本研究同时使用了在纸张表面成膜性能更为优异的表面施胶淀粉作为AKD的载体，两者复配优化发挥协同作用[25]，在纸张表面均匀地形成疏水涂层。纸张表面经过疏水改性后，再通过喷墨打印技术，将含有表面活性剂(二异辛基琥珀酸酯磺酸钠盐)溶液的品红色自制墨水(图2(b))，按照设计图案选择性沉积在疏水纸表面，最终构建出亲水性微流控通道。其中，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠盐作为一种快速渗透剂，其本身兼具亲水性基团和疏水性长链结构，当含有表面活性剂成分的墨水与纸张表面的β-酮酯接触时，分子间的疏水基团(烷基长链)“相似相溶”、相互结合。这时，亲水性磺酸基团重新暴露在外侧，从而实现了打印通道区域从疏水向亲水性的转变，最终形成可视化纸基微流道，如图2(c)所示。

2.2 表面施胶剂配比对流体在通道内扩散效果的影响

为了充分发挥AKD和淀粉表面施胶剂的协同作用，本研究对AKD与表面施胶淀粉的配比进行了工艺优化。将糊化的表面施胶淀粉与AKD均匀混合分别配制质量比为8∶2、7∶3和6∶4的混合液(其总固含量约为10.4%)，使用涂布机在纤维素纸表面沉积一层薄液，测得涂布量分别为15.54、15.87、15.89 g/m2。经不同的表面施胶剂处理后，纸张表面疏水性变化以及液体在亲水性通道内的扩散效果，如图3所示。

由图3可以发现，不同配比的表面施胶剂对纸张表面进行改性后，均表现出优异的疏水性能(水接触角均大于118°)，而随着AKD绝干占比的提高，打印区域亲水性略有降低，但其接触角仍小于9.2°，并未影响到流体在通道内的均匀扩散(图3(b))。当表面施胶剂配比为m表面施胶淀粉/mAKD=7∶3时，液体在亲水通道内的扩散效果最佳。疏水屏障将液体很好地限制在通道内，且界限分明，测得通道的实际宽度为(2.04±0.04)mm(图3(a)，3(c))。同时，在纸张背面也未有液体渗透的痕迹，从而也有效解决了液体在亲水通道内的z向扩散问题(图3(a))。从机理上对这一现象进行分析，是因为当AKD含量较高(表面施胶剂配比为m表面施胶淀粉/mAKD=6∶4)时，在纤维表面会有更多的长碳基团暴露在外面，表面能更高，憎液(疏水)性能更加突出(接触角相对变大)，纤维界面不易被润湿，液体在通道内的流动受阻，没有形成完整的扩散效果；而当AKD含量较低(表面施胶剂配比为m表面施胶淀粉/mAKD=8∶2)时，过高的表面施胶淀粉使用量赋予了涂布表面相对更好的亲水性能(接触角相对变小)，导致疏水屏障效果变差，更易发生表面润湿，所以液体在通道内流动时发生了一定程度的边缘外渗，产生不规整的扩散结果，影响测试准确度。在优化的表面施胶剂配比(m表面施胶淀粉/mAKD=7∶3)条件下，则很好地平衡了涂布纸张表面的疏水和亲水性能，发挥了表面施胶淀粉和AKD的协同作用，可以在纸张表面均匀地构建流体扩散通道。

图3 表面施胶剂配比对纸张表面润湿性及通道内液体扩散性的影响Fig.3 Effect of surface sizing agent ratio on paper surface wettability and liquid diffusion in channels

2.3 压光处理对流体在通道内扩散效果的影响

压光是工业应用中的一项成熟技术，对纸张进行压光处理，可提高纸张的紧度和平滑性，使纸张的印刷适应性得到改善[26]，进而提升纸张经喷墨打印时的精度。为研究压光处理对流体在通道内扩散效果的影响，文中选取经表面施胶处理的纸张(表面施胶剂配比m表面施胶淀粉/mAKD=7∶3)，分别对其进行不压光和压光处理，并对液体在相应微流道内的扩散行为进行了对比，结果如图4所示。

图4 压光处理对微流道内液体扩散的影响Fig.4 Effect of calendering on liquid diffusion in the channel

由图4可见，未经压光处理的纸张的微流控通道虽整体轮廓较清晰，但边缘出现少量的液体外渗，在实际的生化检测中容易导致交叉污染；而经压光处理后，纸张的微流控通道表现出良好的限液性能，并且纸张表面的打印精度也得到显著提高。同时，经测试发现，未压光纸张的紧度为0.48 g/cm3，而压光处理后纸张的紧度提高至0.53 g/cm3，表面粗糙度则由7.40 μm降低至5.67 μm，纸张表面变得更加平滑。综上可知，对纸张进行压光处理，不仅提高了纸张的紧度及平滑度，也进一步提升了微流道的设计精度和对液体的限液能力。

2.4 纸基微流控芯片的图案化设计

喷墨打印作为一种数字印刷技术，可实现按需批量印刷[27]。本研究中，可以通过喷墨打印来设计构造各种精细复杂图案的纸基微流控芯片，如图5所示。其中，Y形、花形、阵列型纸基微流控芯片多用于物质的检测研究中，例如：物质的浓度检测(如食品中亚硝酸盐浓度的检测)、物质的成分检测(如尿液中葡萄糖和蛋白质的检测)等。因此，纸基微流控芯片的实际应用能够为食品、医疗和环境领域提供简单、高效的低成本检测方式。

图5 纸基微流控芯片的图案化设计Fig.5 Different drawings built by inkjet printing

2.5 纸基微流控芯片在亚硝酸盐检测中的应用

基于以上研究，文中利用表面施胶及喷墨打印技术成功构建了纸基微流控芯片。为评估该纸基芯片的实际应用价值，基于比色法，利用Griess试剂与亚硝酸盐的特异性颜色反应构建纸基芯片并将其用于亚硝酸盐的检测。为探究不同浓度的亚硝酸盐溶液在该纸基芯片上产生的颜色变化，实验中设计了直径为4.5 mm的圆形点阵图，检测结果如图6(a)所示。由图6(a)可知，不同浓度的亚硝酸盐溶液与Griess试剂反应后表现出不同程度的颜色变化，且随着亚硝酸盐浓度的增加，颜色逐渐加深。利用手持式色差仪测得相对空白区域的颜色色差，如图6(b)所示。通过对亚硝酸盐溶液浓度与颜色色差值之间的关系进行非线性曲线拟合，得到曲线拟合方程为y=1.799+8.745x0.453(相关系数R2=0.993 5)，表明色差值与亚硝酸盐溶液浓度之间呈现良好的相关性。同时，所测样品的色差值均大于6，根据CIE对色差的评价，该范围被定义为大色差范围，会给人强烈的视觉感受，有利于区分不同亚硝酸盐浓度下产生的颜色变化。综上可知，本实验构建的纸基微流控芯片可满足实际检测的要求。

图6 纸基芯片用于亚硝酸盐的检测Fig.6 Paper-based chip for the detection of nitrite

3 结语

文中提出了一种集成表面施胶和喷墨打印技术的纸基微流控芯片构建方案。纸张通过表面施胶工艺实现疏水化改性，在表面施胶剂配比(m表面施胶淀粉/mAKD)为7∶3、并通过表面压光处理后构建的微流道展现出优异的限液性能，液体可以在亲水通道内实现完整地定向扩散，同时解决了液体的z向扩散问题，也进一步提升了微流道的设计精度。而且，采用该法构建的纸基微流控芯片能够实现对亚硝酸盐溶液质量浓度的检测，亚硝酸盐溶液质量浓度与芯片表面颜色色差值之间的曲线拟合方程为y=1.799+8.745x0.453，相关系数R2达0.993 5。

该方案操作流程简单、原料价廉，有望进一步实现规模化生产，对于临床诊断、食品安全、环境监测等领域具有重要意义。