基于网络药理学和分子对接技术探讨清肺饮治疗支气管哮喘的作用机制

王 莹 刘丽琴

支气管哮喘是一种慢性炎症性气道疾病，通常由环境过敏原引起，具有复杂的病理机制，临床表现为喘息、气促、胸闷、咳嗽。此外，支气管哮喘也可引起呼吸衰竭、心血管疾病、肾脏疾病、猝死等并发症[1-2]。支气管哮喘发病机制包括气道炎症、气道高反应性、可逆性气道受限、气道重塑、气道免疫炎症和神经调节，多种细胞（如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、T 淋巴细胞等）及细胞组分参与气道炎症的发生[3]。支气管哮喘归属中医“哮证”“喘证”“上气”等范畴，中医认为，哮病的发生是由于宿痰伏肺，遇诱因或感邪引触，以致痰阻气道，肺失肃降，痰气相搏所引起的发作性痰鸣气喘疾患。清肺饮（又名宣肺止咳合剂）是浙江大学医学院附属杭州市胸科医院院内制剂，由麻黄、葛根、苦杏仁、知母、甘草、僵蚕、石膏七味药组成，具有止咳平喘、清热宣肺的功效，对支气管哮喘有良好的治疗作用，临床疗效显著[4]，但具体的作用机制尚不明确。网络药理学是一门新兴学科，采用“多成分、多靶点、多途径”的方法，系统地研究“药物-靶点-通路-疾病”之间的相互作用，其观念与中医药整体观、辨证论治的原则一致[5]。本研究采用网络药理学方法整体性探究清肺饮治疗支气管哮喘的作用机制，以期为清肺饮的基础研究提供新的参考依据。

1 材料与方法

1.1清肺饮中化学成分的收集 借助中药系统药理数据库和分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/），检索得到清肺饮中药物麻黄、葛根、苦杏仁、知母、甘草、僵蚕、石膏的化学成分。

1.2药物有效成分筛选 利用TCMSP 数据库以“口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18、细胞渗透性（Caco-2）＞-0.4”[7]为筛选条件对清肺饮所含化合物进行筛选，并查询其对应的靶标蛋白。收集化合物靶标蛋白后再通过UniProt 数据库，限定物种为人，将检索得到的所有蛋白靶标转化为规范的靶点蛋白基因标识符（Gene Symbol）。

1.3支气管哮喘相关疾病靶点的遴选 借助Genecards、OMIM 数据库搜索关于支气管哮喘疾病的靶点，以“asthma”为检索词进行检索，收集整合得到与支气管哮喘疾病相关的靶点。

1.4药材-化合物-靶点网络的构建 将清肺饮所含中药、化合物及交集靶点用Cytoscape 3.7.2 软件构建中药-化合物-靶点网络，对其进行分析，结合在线韦恩图Venny 2.1，得出不同药物之间的交集化合物，探讨清肺饮的潜在物质基础。

1.5PPI 网络构建 将清肺饮与支气管哮喘交集后的共同靶点导入String 数据库，并将限定物种为“Homosapiens”设定最低相互作用阀值为“high confidence”0.700 其余参数保持默认设置，进行筛选。结果导入Cytoscape 软件构建和分析蛋白相互作用网络，并按“degree”大小进行筛选，构建核心靶点的PPI 网络图。

1.6靶点通路分析 为了进一步了解交集基因的功能以及在信号通路中的作用，将筛选得到的交集靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），在DAVID 的基因列表通用管理面板中复制粘贴基因列表，Select Identifier 选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type 设置为“Gene List”，提交基因列表，并限定物种为“Homo sapiens”，进行GO 生物学过程富集分析和KEGG 信号通路富集分析，根据Count 排序取前20，将其结果利用Graphpad Prism 绘制成柱状图，使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）数据库绘制气泡图，进行可视化。

1.7成分-靶点分子对接 利用AutoDock 软件对清肺饮筛选得到的Degree 前5 位的核心靶点与关键成分以及临床常用治疗药物进行分子对接验证。具体步骤如下：（1）先从PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）下载核心靶蛋白的结构3D 结构的PDB 格式文件，并运用PyMOL 软件对蛋白质分子进行去水、去配体等操作，最后使用AutoDock 软件对靶点蛋白进行加氢及计算电荷处理后，保存为pdbqt 格式文件。（2）在TCMSP 网站下载活性成分的结构文件（MOL2 格式），再用ChemOffice 软件转换为3D 结构，并使其结构能量最小，最后使用AutoDock 软件对3D 结构进行加氢及计算电荷处理后，保存为pdbqt 格式文件。（3）利用AutoDock 对成分与靶点之间的结合活性进行评价，最后运用PyMOL 软件使对接文件可视化。

2 结果

2.1活性化合物筛选结果 通过TCMSP 数据库，根据“OB≥30%、DL≥0.18，Caco-2＞-0.4”筛选后，搜索到134 个符合条件的有效化合物，其中麻黄20个，葛根3 个，知母14 个，苦杏仁18 个，甘草88 个，整合后得到128 个化合物。

2.2 清肺饮成分靶点与支气管哮喘疾病靶点交集结果 清肺饮筛选的成分对应的靶点有121 个，按“1.3”项方法筛选到与支气管哮喘相关的靶7553 个，二者交集韦恩图见图1。

图1 清肺饮靶点与支气管哮喘靶点Venn 图

2.3药材-化合物-靶点网络 药材-化合物-靶点网络总共包括259 个节点（5 个药材节点、133 个化合物节点、121 个靶点节点）和1274 条边，如图2 所示，绿色箭头代表药材，圆形代表化合物，蓝色正方形代表靶点基因，玫红色代表麻黄药材所含的化合物，紫色代表葛根药材所含的化合物，橘色代表知母药材所含的化合物，黄色代表苦杏仁药材所含的化合物，红色代表甘草药材所含的化合物，每条边表示药材中所含化合物及化合物与靶点相互作用关系。从图中可看出清肺饮中存在一个化合物与多个靶点作用，同时也存在不同化合物共同作用于同一个靶点的现象，这体现了中药多成分与多靶点之间共同作用的机制。在网络中，一个节点的度值表示网络中和节点相连的节点的数量，利用节点度值排序确定网络关键节点是目前网络分析的主要策略之一，根据网络中的拓扑学性质筛选的中心度值（betweenness centrality）、亲中心度值（closeness centrality）、等级值（degree）较大的节点进行分析，一般认为节点的连接度大于等于所有节点连接度2 倍中位数则对整个网络具有重要的贡献意义。网络中度值大于2倍中位数（成分度值中位数＝8，靶点度值中位数＝3）的成分有11 个，靶点有26 个。排名前5 位的化合物分别是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山奈酚、MOL000006-木犀草素、MOL000354-异鼠李素、MOL000449-豆甾醇，度值分别是78、35、29、18、18，排名前10位的靶点分别是ESR1、PPARG、AR、NCOA2、PTGS1、PRSS1、GSK3B、ESR2、CHEK1、ACHE，度值分别为87、81、80、70、69、67、63、60、54、31。

图2 清肺饮药材-化合物-靶点网络

2.4清肺饮中交集化合物 由药材-化合物-靶点网络可知，清肺饮中不同的药材里面存在相同的化合物的情况可知，MOL000422-山柰酚为麻黄、知母、甘草所共有；MOL000098-槲皮素为麻黄、甘草所共有；MOL000449-豆甾醇为麻黄、知母、苦杏仁所共有；MOL000358-β-谷甾醇为麻黄、葛根所共有；MOL000492-儿茶素为麻黄、苦杏仁所共有，MOL000392-芒柄花黄素为葛根、甘草所共有，MOL000359 -谷甾醇、MOL002311 -甘草醇、MOL004841-甘草查尔酮B、MOL004908-光甘草定、MOL005017-3，9-二羟基-4-异戊二烯基香豆素为甘草、苦杏仁所共有。

2.5PPI 网络构建 将上述101 个药物作用靶点导入STRING 11.0 数据库，获得蛋白相互作用数据信息，然后导入Cytoscape 软件，选取其中度值（degree）大于2 倍中位数的靶点有14 个，这14 个靶蛋白可能是PPI 网络中的核心靶点，构建14 个核心靶蛋白的PPI 网络图（见图3），网络中共有14 个节点和66条边，节点的大小和颜色深浅依据degree 而设定，即节点越大和颜色越深对应的靶基因的degree 越大。

图3 清肺饮核心靶点PPI 网络

2.6靶点通路分析 DAVID 中GO 功能富集分析得到GO 条目252 个（FDR＜0.05），其中生物过程（BP）条目116 个，细胞组成（CC）条目44 个，分子功能（MF）条目92 个，分别占46%、17%、37%，排名前20 位的条目见图4。

图4 清肺饮作用靶点的GO 富集分析的前20 个通路

KEGG 通路富集筛选得到79 条信号通路（P＜0.05），涉及癌症通路、乙型肝炎通路、TNF 信号通路、MAPK 通路等，见图5。

图5 清肺饮作用靶点KEGG 富集分析的前20 条通路气泡图

2.7清肺饮关键活性成分-支气管哮喘靶基因-关键通路网络图 基于Cytoscape 软件平台，选取degree 排名前20 的清肺饮主要活性成分节点、120 个靶基因节点、20 个KEGG 信号通路构建清肺饮关键成分-靶基因-信号通路的网络图，见图6。

图6 成分-核心靶点-信号通路图

2.8分子对接结果和分析 药材-化合物-靶点网络中degree 值排名前5 位的化合物分别是MOL000098 -槲皮素、MOL000422 -山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL000354-异鼠李素、MOL000449-豆甾醇，PPI 中degree 值排名前5 位的核心靶点分别是：MAPK8、ESR1、EGFR、IL6、VEGFA。将PPI中degree 值排名前五位的核心靶点与药材-化合物-靶点网络中degree 值排名前5 位的化合物进行分子对接，同时根据《中国支气管哮喘防治指南》（2016 年版）推荐选择常用药β2 受体激动剂沙丁胺醇作为阳性对照药物，以分子对接结合能来评价配体分子与受体分子的结合程度。一般认为分子对接结合能的绝对值越大，化合物与靶点亲和力越强，构象越稳定。绝对值大于4.25 表示具有一定的结合活性，大于5.0 表示具有较好的结合活性，大于7.0表示具有强烈的结合活性，分子对接结果见表1，关键药效成分与核心靶点的最低结合能均大于5.0kcal/mol，且大于阳性对照药物的结合能，说明这些成分与靶点之间均能够稳定的结合，选取结合能大于7.0kcal/mol 的对接结果利用Pymol 软件绘图，结果见图7，分子对接结果提示5 个靶点中，MAPK8与豆甾醇的对接评分绝对值最大；靶点MAPK8、ESR1、EGFR、IL6、VEGFA 分别与豆甾醇、异鼠李素、豆甾醇、豆甾醇、豆甾醇的亲和力最强，提示豆甾醇可能是清肺饮治疗支气管哮喘的关键成分。由图可见，槲皮素与MAPK8 在VAL-196、VAL-187、THR-178、ARG-150 处形成氢键；木犀草素与MAPK8 在LEU-302、TYR-266、ASP-305、CYS-245 处形成氢键，与ESR1 在LEU-387、THR-347 处形成氢键；异鼠李素与MAPK8 在GLU-109、MET-111 处形成氢键，与ESR1 在SER-527、CYS-417、SER-341、MET-343 处形成氢键；豆甾醇与MAPK8 在ASN-114、GLN-117 处形成氢键，与ESR1 在MET-358 处形成氢键，与IL6 在LEU-46 处形成氢键，与VEGFA 在GLU-103、TYR-25 处形成氢键。

表1 清肺饮活性成分、推荐药物与支气管哮喘核心靶点的分子对接结果

图7 关键药效物质-核心靶点分子对接模式图

3 讨论

3.1核心成分的治疗作用分析 本研究运用网络药理学构建清肺饮的药材-化合物-靶点网络，得到活性成分133 个以及对应靶点121 个。通过分析网络关系中度值排名前5 的活性成分发现，5 个化合物中有4 个属于黄酮类成分，豆甾醇属于植物甾醇类物质。研究证实，槲皮素可通过降低炎症因子IL-1、IL-6、IL-10 的表达量而达到抗炎症的效果[6]。豆甾醇具有显著抗炎作用，可显著降低炎症因子IL-6、IL-1、以及环氧合酶2 mRNA 表达，通过减少PGE2 和NO的释放发挥其抗炎作用[7]。分子对接结果显示，关键成分与靶点之间均能够稳定的结合而且结合体构象稳定，表明这些成分可能为清肺饮治疗支气管哮喘的关键成分和靶点，其中，豆甾醇与四个关键靶点的对接评分绝对值最大，提示豆甾醇可能是清肺饮治疗支气管哮喘的关键成分。因TCMSP 数据库中动物药和矿物药成分及靶点信息较少，因此未对处方中的石膏及僵蚕进行成分及靶点的检索，后期会通过文献检索的方式对相关信息进行挖掘，以更全面地了解清肺饮的活性成分及靶点信息。

3.2核心靶点表达与支气管哮喘的关联分析 PPI网络结果显示，得到的14 个核心靶点主要涉及炎症、免疫调节、细胞凋亡、信号转导、癌症等。其中MAPK8、ESR1、EGFR、IL6、VEGFA 相关度最高，研究发现，MAPK 信号转导途径是参与支气管哮喘发病及进展的一条重要通路，通过调控免疫/炎症细胞和气道结构细胞，诱发支气管哮喘[8]，IL-6 在支气管哮喘发作期增高，病情缓解后逐渐恢复原水平，参与支气管哮喘发生、发展的反应过程，可以用来判断支气管哮喘的诊治情况，评估支气管哮喘的预后等[9]。EGFR 是通过与其相应的配体结合，促进气道平滑肌细胞和纤维母细胞的增殖和迁移，参与上皮细胞及组织纤维化的过程，进而使气道发生重塑，EGFR 的表达量主要在结构性损伤区域增高，且增高程度与支气管哮喘的严重性相关[10]。VEGFA 的大量表达，可以维护肺血管结构、功能的正常及修复损伤等，进而参与支气管哮喘气道重塑[11]。

3.3涉及主要信号通路与支气管哮喘的关联分析本研究对交集靶点进行了GO 功能富集和KEGG 通路富集，结果发现清肺饮治疗支气管哮喘的生物过程主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ转录因子结合、信号转导、凋亡过程的负调控、DNA 结合转录激活、氧化还原过程、蛋白质磷酸化等方面，说明清肺饮的平喘作用可能是一个复杂的多途径协同作用的结果。KEGG通路分析结果显示，核心靶点主要富集于TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路等与支气管哮喘相关的通路，TNF 信号通路是介导炎症和免疫损伤的重要通路之一，其中TNF-α 是其重要结合位点，通过活化下游NF-κB、Bcl-2 等蛋白激酶可激活NF-κB 信号通路，进而调控炎症因子的表达[12]。PI3K-Akt 信号通路可以通过多种机制抑制小鼠气道重塑，PI3K 在支气管哮喘的发病过程中，能够调Th细胞的分化及细胞因子的产生，从而影响支气管哮喘炎症，发展参与支气管哮喘的发病[13]。MAPK 在哺乳动物细胞中存在ERK、JNK、p38MAPK 等14 条信号通路，MAPK 信号转导途径是参与支气管哮喘发病及进展的一条重要通路，通过调控免疫/炎症细胞和气道结构细胞，引起气道高反应和气道重塑，造成Th1/Th2 免疫应答失衡，最终诱发支气管哮喘[8]。

总之，本研究基于清肺饮在治疗支气管哮喘的临床有效性，采用网络药理学的方法，结合分子对接对其潜在药效成分、靶标、通路进行了研究，初步明确清肺饮与支气管哮喘疾病之间的关系，并实现活性分子与靶点蛋白之间关系的可视化，揭示了清肺饮治疗支气管哮喘是多个活性成分通过多条途径作用于多个靶点蛋白，符合中药多成分多靶点的特点。但是，目前的工作尚停留在虚拟筛选，只能为研究其作用机制提供参考，后续课题组拟设计动物实验，对清肺饮治疗支气管哮喘的作用机制进行深入探讨，从而更系统科学地阐明其药理机制，为其临床应用和新药研发提供更多参考。